α-突触核蛋白转基因帕金森病模型小鼠早期出现社交认知障碍*

任湘鹏 ， 侯志东 ， 田 静， 徐 煌， 王琰萍

（1嘉兴学院医学院，浙江 嘉兴 314001；2温州医科大学眼视光学院，浙江 温州 325027；3嘉兴学院附属第二医院神经内科，浙江 嘉兴 314001）

帕金森病（Parkinson disease，PD）是第二大常见的进行性神经退行性疾病，其主要病理特征是α-突触核蛋白（α-synuclein，αS）在神经元胞体内沉积形成路易小体（Lewy bodies），以及黑质多巴胺（dopamine，DA）能神经元变性丢失。PD 临床表现为静止性震颤、肌强直、运动迟缓及姿势平衡障碍等典型运动症状，在临床前驱期还呈现出多样化的非运动症状，如嗅觉、睡眠、便秘、认知及情绪障碍等［1-2］。识别PD 的非运动症状是实现早期诊断的重要依据［3］。目前学术界普遍认为αS 异常聚集和病变传播是PD 发病的核心机制［4-5］，也是PD非运动症状多样化的病理基础［6］。因此，基于αS的动物模型成为研究PD 非运动症状的理想动物模型［7］。Giasson 等［8］利用小鼠朊蛋白启动子过表达人A53T 突变型αS 的方法，制作出A53T αS 转基因（trangenic，TG）小鼠，并发现该TG 小鼠最早在8 月龄可出现运动障碍，且脑内出现αS 病理性包涵体的广泛分布。本研究以6 月龄A53T αS TG小鼠为模拟早期PD的动物模型，系统研究其行为学表型及相关病理基础，以期为阐明PD 的非运动症状及病理机制提供实验基础。

材料和方法

1 动物

A53T αS TG 小鼠（#004479）购自 Jackson 实验室。实验组选用6 月龄A53T αS TG 小鼠，对照组选用同窝生的正常野生型（wild-type，WT）小鼠，每组12只，雌雄不限，体重25～30 g。小鼠均饲养在SPF级动物房中，自由饮水进食。实验开展前，小鼠提前1周运至行为学测试专用动物房以适应环境。动物房室温22～25 ℃，湿度60%，光暗周期为12 h。所有动物实验遵循我国《实验动物护理和使用指南》执行。

2 主要试剂

酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase，TH）抗体（ab112）、神经元核抗原（neuronal nuclear antigen，NeuN）抗体（ab177487）、Polo 样激酶 2（Polo-like kinase 2，PLK2）抗 体（ab137539）和 GAPDH 抗 体（ab8245）购自Abcam；Ser129 磷酸化α-突触核蛋白（phosphorylated α-synuclein，pSyn）抗体（pSyn#64）购自Wako；泛素（ubiquitin，Ub）抗体（sc-8017）和p62抗体（sc-48402）购自Santa Cruz；生物素标记的驴抗鼠Ⅱ抗购自Jackson；山羊抗鼠Alexa Fluor 488、山羊抗兔Alexa Fluor 555 和驴抗鼠Alexa Fluor 594 Ⅱ抗购自Invitrogen；HRP 标记的山羊抗兔和山羊抗鼠Ⅱ抗购自碧云天公司；ABC 试剂盒和DAB 试剂盒购自Vector；基因组提取试剂盒为Qiagen 产品；其他生化试剂均为进口分装或国产分析纯。小鼠基因型鉴定所用引物由上海吉凯基因技术有限公司根据设计合成，序列见表1。

表1 引物序列Table 1. Sequences of the primers

3 主要方法

3.1 小鼠基因型鉴定 采用Jackson 推荐的标准PCR 方法鉴定 A53T αS TG 及 WT 小鼠的基因型。小鼠剪尾，提取基因组DNA 作为PCR 模板。合成两对PCR 鉴定的特异性引物，分别用于扩增内参照及TG序列。PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳、成像，根据特异性扩增条带大小判定样本基因型。

3.2 行为学检测 对实验小鼠同时进行一系列行为学测试，测试顺序随机，且对实验操作者采用盲法。所有行为学测试均在上午08：00～12：00 进行，每组n=12。每只小鼠测试结束后，用70%酒精擦拭行为学实验装置并用吸水纸擦干，以减少气味干扰。

3.2.1 旷场实验（open-field test）［9］实验箱为一个尺寸为40 cm×40 cm 的敞箱，上方安装有摄像机，与EthoVision XT 分析系统相连接，实时追踪记录并采集分析小鼠10 min 内在实验箱中总的运动距离，以反映小鼠的自发运动能力。

3.2.2 悬挂实验（wire hang test）［10］使用一个铺有柔软垫料的大鼠笼和笼盖，高度定为25 cm 以上；将实验小鼠置于笼盖上，轻摇使其抓住笼盖杆；翻转并固定笼盖，同时用秒表计时；当小鼠脱离笼盖跌落至垫料上时，结束计时，记录悬挂时间，以反映小鼠的肌力和运动能力。

3.2.3 精细运动测试（fine movement test）［11］在每个鼠笼中左上位置放一个托盘，托盘内放入30 颗原味生瓜子；随着时间的变化，小鼠嗑瓜子数目逐渐提高，表明小鼠在该行为学测试中训练成功；分别记录1、3、8和24 h时小鼠磕的总瓜子数，以反映小鼠的精细运动能力。

3.2.4 Y 迷宫自发交替行为（spontaneous alternation behavior，SAB）实验［9］标记 Y 迷宫 3 个臂分别为 A、B 和C，将小鼠置于A 臂末端，让小鼠在 Y 迷宫内自由探索5 min；记录小鼠依次进臂的顺序，统计正确的轮替次数（依次进入3 个不同的臂）和总轮替次数（总进臂次数-2），两者比值为SAB 正确率（%），以此评价小鼠的工作记忆。

3.2.5 高架十字迷宫（elevated plus maze）［10］将小鼠置于高架十字迷宫的中心区域，即4个臂交接之处，头朝着开放臂，录像设备实时记录并采集小鼠5 min内在开放臂与封闭臂的活动时间，以小鼠在开放臂停留的时间反映小鼠的焦虑状态。

3.2.6 悬尾实验（tail suspension test）［12］将小鼠尾部后1/3处用胶带固定在金属笼盖上，悬挂在地板上方，头部距离台面15 cm，实时采集小鼠5 min内的肢体运动情况，记录肢体不动的时间，以反映小鼠的抑郁样行为。

3.2.7 三箱社交实验（three-chambered social approach task）［13］实验操作箱为40 cm×20 cm的3个小室组成，小室之间有隔板，仅留7 cm宽的通道。箱子上方安装有与行为学记录分析系统相连接的摄像机，记录小鼠在箱子中的运动轨迹。适应期（第一时相）：在操作箱的左上和右下各放置一个空塑料罩，将测试鼠轻轻放入中间小室，自由探索10 min。测试期：（1）第二时相：选一只目标鼠随机放进其中一个塑料罩内，让测试鼠自由探索10 min，统计测试鼠分别在3个小室内停留的时间，以测试鼠和目标鼠的交流时间反映其社交能力；（2）第三时相：另选一只目标鼠放进另一个塑料罩内，让测试鼠再次自由探索10 min，统计测试鼠分别在左、右小室停留的时间（测试鼠与新旧两只目标鼠的交流时间）反映其社交记忆能力。

3.3 组织病理学检测 行为学测试结束，小鼠经麻醉、灌注、断头取脑、4%多聚甲醛溶液固定及脱水等一系列预处理后进行皮层、纹状体和黑质区冠状位冰冻切片，每组n=6，切片厚度30 μm，存放于4 ℃冰箱的冰冻保存液中备用。

3.3.1 免疫组织化学染色［9］采用免疫组化染色法检测两组小鼠脑内黑质区TH 阳性细胞数及皮层区αS 包涵体。脑片室温复温、漂洗后，免疫染色抗体稀释液1∶1 000 稀释Ⅰ抗（TH 和pSyn 抗体），室温慢摇孵育过夜。用免疫染色抗体稀释液1∶1 000 稀释生物素标记的Ⅱ抗，室温孵育1 h。用ABC 复合物室温孵育1 h，以DAB 溶液显色10 min。苏木素复染细胞核45 s 后，室温下晾干、梯度脱水、中性树胶封片晾干后在显微镜下拍摄。

3.3.2 免疫荧光共染［9］将 A53T αS TG 小鼠皮层脑片进行pSyn 与Ub（αS 包涵体的另一主要成分）、p62（蛋白质聚集的标志物）及NeuN（神经元特异性标志物）的免疫荧光共染。脑片室温复温、漂洗后，用免疫染色抗体稀释液稀释Ⅰ抗（pSyn，1∶1 000；Ub 和p62，1∶50；NeuN，1∶500），室温孵育过夜。用免疫染色抗体稀释液1∶1000 稀释Ⅱ抗，室温避光孵育2 h。脑片漂洗，用含DAPI 的抗荧光淬灭封片剂封片后，共聚焦显微镜z轴扫描拍摄。

3.4 Western blot［14］PLK2 能特异性磷酸化 αS 的Ser129 位点［15］，对αS 病变传播具有重要意义。为探究A53T αS TG 小鼠皮层神经元内的αS 病理性包涵体是否与PLK2 相关，本研究采用Western blot 法定量检测两组小鼠脑内皮层区PLK2的表达水平，同时定量检测两组小鼠脑内黑质区TH 的表达水平。小鼠迅速断头取脑，分离出皮层、纹状体和黑质区脑组织，每组n=6。加入强RIPA 细胞裂解液和蛋白酶抑制剂进行裂解，4 ℃、9 800×g离心 10 min 后取上清液，并采用BCA 法进行蛋白定量。用12% SDSPAGE 分离蛋白并转印至 PVDF 膜后，5% BSA 室温封闭1 h，加入Ⅰ抗（TH，1∶1 000；PLK2，1∶3 000；GAPDH，1∶5 000）4 ℃孵育过夜（至少16 h）。次日，反复洗膜3 次后，HRP 的标记Ⅱ抗（1∶1 000）室温孵育2 h，化学发光法显影，扫描。用图像处理系统对条带灰度进行分析，以GAPDH作为内参照。

4 统计学处理

用SPSS 16.0 统计软件进行分析。数据作图采用GraphPad Prism 6 软件完成。数据采用均数±标准误（Mean±SEM）表示。方差齐性检验采用Levene法，两组样本均数比较采用独立样本t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 A53T αS TG小鼠基因型鉴定PCR结果

“+”显示的样本PCR 扩增条带大小约为250 bp，和A53T αS TG 特异性引物的扩增条带预期大小相符，均为 A53T αS TG 小鼠；其余样本的 PCR 扩增条带大小超过300 bp，均为WT小鼠，见图1。

Figure 1. PCR results for genotype identification of A53T αS TG mice. M：DNA marker；1 to 16：sample number；CON：negative control；+：A53T αS TG positive sample.图1 A53T αS TG小鼠基因型鉴定PCR结果

2 6 月龄A53T αS TG 小鼠未出现运动、工作记忆及情绪样行为障碍

旷场实验结果显示，与WT 小鼠相比，A53T αS TG 小鼠在旷场实验箱中10 min 内总的运动距离无显著差异（P＞0.05），见图2A。悬挂实验结果显示，与WT 小鼠相比，A53T αS TG 小鼠的悬挂时间无显著差异（P＞0.05），见图2B。精细运动测试结果显示，随着时间的变化（1、3、8 和24 h），两组小鼠的嗑瓜子数目均逐渐提高，而在每个时点两组间差异均无统计学显著性（P＞0.05），见图2C。SAB 检测结果显示，A53T αS TG小鼠在Y迷宫中5 min内的SAB正确率与WT小鼠相比无显著差异（P＞0.05），见图2D。高架十字迷宫检测结果显示，A53T αS TG 小鼠5 min内在开放臂停留的时间与WT 小鼠相比无显著差异（P＞0.05），见图2E。悬尾实验结果显示，与WT小鼠相比，A53T αS TG小鼠5 min内肢体静止不动的时间无显著差异（P＞0.05），见图2F。

Figure 2. Six-month-old A53T αS TG mice did not develop motor，working memory and emotion-like behavior disorders. A：openfield test；B：wire hang test；C：fine movement test；D：spontaneous alternation behavior（SAB）test；E：elevated plus maze test；F：tail suspension test. Mean±SEM. n=12.图2 6月龄A53T αS TG小鼠未出现运动、工作记忆及情绪样行为障碍

3 6月龄A53T αS TG小鼠出现社交认知障碍

三箱社交行为学测试（图3A）结果显示，在经过操作箱适应期（第一时相）后，两组小鼠在测试期第二时相停留在目标鼠小室的时间较空塑料罩小室相比均显著增加（P＜0.05）；但与WT 小鼠相比，A53T αS TG 小鼠停留在目标鼠小室的时间并无显著差异（P＞0.05），见图3B。在测试期第三时相，WT 小鼠与新目标鼠的交流时间［（238.59±21.50）s］较旧目标鼠［（194.76±26.21）s］显著增加（P＜0.05）；反之，A53T αS TG 小鼠与新目标鼠的交流时间［（161.05±17.33）s］较旧目标鼠［（251.65±21.67）s］显著缩短（P＜0.01）；与WT 小鼠相比，A53T αS TG 小鼠与新目标鼠的交流时间同样显著缩短（P＜0.01），见图3C。

4 6 月龄 A53T αS TG 小鼠脑内黑质区 TH 的表达水平未出现改变

免疫组化染色结果显示，与WT 小鼠相比，A53T αS TG小鼠脑内黑质区未出现TH阳性神经元的变性丢失，见图4A。Western blot 检测结果显示，A53T αS TG 小鼠脑内黑质区TH 的表达水平未出现显著改变（P＞0.05），见图4B。

Figure 3. Six-month-old A53T αS TG mice developed social cognition impairment. A：social cognitive ability tested by three-chambered social approach task；B：A53T αS TG mice showed normal social activity in phase 2；C：A53T αS TG mice showed social cognition impairment in phase 3. Mean±SEM. n=12.*P＜0.05 vs empty object；#P＜0.05，##P＜0.01 vs old mouse；△△P＜0.01 vs WT.图3 6月龄A53T αS TG小鼠出现社交认知障碍

Figure 4. The expression level of TH did not change in the substantia nigra of 6-month-old A53T αS TG mice. A：representative immunohistochemical staining images for TH in the substantia nigra，A53T αS TG mice did not show degeneration and loss of TH-positive neurons in the substantia nigra region of the brain compared with WT mice（scale bar=0.1 mm）；B：representative Western blot images and statistical results of TH expression in the substantia nigra. Mean±SEM. n=6.图4 6月龄A53T αS TG小鼠脑内黑质区TH的表达水平未出现改变

5 6 月龄 A53T αS TG 小鼠脑内皮层区出现 αS 病理性包涵体

免疫组化染色结果显示，A53T αS TG 小鼠皮层脑区出现pSyn 包涵体，纹状体及黑质脑区尚未发现病理性包涵体；pSyn 包涵体阳性的皮层细胞百分比为（20.68±4.41）% ，显 著 高 于 对 照 组［（3.05±0.87）%；P＜0.01］，见图5A。免疫荧光共染及共聚焦显微镜z轴扫描显示，pSyn与Ub、p62及NeuN均有良好的共定位表达，见图5B。

6 6 月龄 A53T αS TG 小鼠脑内皮层区 PLK2 的表达水平上调

Western blot 检测结果显示，与WT 小鼠相比，A53T αS TG 小鼠脑内皮层PLK2 的表达水平显著上调（P＜0.01），见图6。

讨 论

Figure 5. The αS pathological inclusions were detected in the brain cortical region of 6-month-old A53T αS TG mice（scale bar=0.01 mm）. A：representative immunohistochemical staining images for pSyn in the cortex and statistical results of pSynpositive cells（arrows point to pSyn-positive αS pathological inclusions）；B：representative immunofluorescence staining images for pSyn（green）co-localized with Ub（red），p62（red）and NeuN（red）were shown，while cell nuclei were stained with DAPI（blue）. Mean±SEM. n=6.**P＜0.01 vs WT.图5 6月龄A53T αS TG小鼠脑内皮层区出现αS病理性包涵体

模拟αS 聚集和传播的αS TG 小鼠是研究PD 非运动症状的理想动物模型，利用不同的TG 过表达策略，研究人员已开发出多种不同的αS TG PD 小鼠模型［7］。本研究以 6 月龄 A53T αS TG 小鼠为模拟早期PD 的动物模型，系统研究其行为学表型及相关病理改变，结果表明6 月龄A53T αS TG 小鼠在运动功能改变之前出现社交记忆障碍，可能与皮层中αS 病理性包涵体相关。

本研究结果表明，6 月龄 A53T αS TG 小鼠尚未出现运动功能障碍及DA 能神经元的选择性变性丢失，但可检测到αS病理性包涵体的存在，证实了6月龄A53T αS TG 小鼠可作为模拟PD 发病早期的动物模型。这与Giasson 等［8］的研究结果一致，其研究显示A53T αS TG 小鼠最早从8个月开始出现进行性运动障碍，平均发病周期在 14～15 月，8～12 月龄 TG 小鼠脑内广泛分布着αS 包涵体。本研究结合旷场实验、悬挂实验及精细运动测试观察两组小鼠的自主运动、肌张力及精细运动能力，结果均表明6 月龄A53T αS TG 小鼠尚未出现运动能力受损。考虑到PD 模型小鼠运动能力改变和非运动行为学表型密切相关，我们可排除后续对PD 模型小鼠非运动功能检测时可能受到的影响。

Figure 6. The expression level of PLK2 was up-regulated in the brain cortical region of 6-month-old A53T αS TG mice. Mean±SEM.n=6.**P＜0.01 vs WT.图6 6月龄A53T αS TG小鼠脑内皮层区PLK2的表达水平上调

情绪障碍是PD 早期的非运动症状之一，主要表现为焦虑、抑郁等［1］。情绪样行为障碍已在不同的αS TG PD 模型小鼠中得到了验证［16-17］，如 Graham等［16］发现，8～12 月龄A53T αS TG 小鼠表现出多动和焦虑样行为的减少。本实验利用高架十字迷宫和悬尾实验检测早期PD 模型小鼠的情绪样行为，结果表明6 月龄A53T αS TG 小鼠未出现焦虑、抑郁等情绪样行为，提示不同月龄的αS TG 小鼠可表现出不同的情绪样行为。

认知障碍是PD 最重要的非运动症状之一，可出现在PD 病程的各个时期［18］，工作记忆是评价认知功能的重要指标。已有多项研究对不同PD TG 小鼠模型的认知功能进行了系统测试［19-21］：Paumier 等［20］的研究表明，6 和 12 月龄 A53T αS TG 小鼠在 Y 迷宫检测中表现出空间记忆损害；Freichel 等［21］利用水迷宫检测了A30P 突变型αS TG 小鼠的工作记忆能力，结果表明，4 月龄TG 小鼠的工作记忆正常，而12 月龄TG小鼠则出现明显的工作记忆障碍。本研究利用Y迷宫自发交替行为学检测早期PD 模型小鼠的工作记忆，结果表明6 月龄A53T αS TG 小鼠尚未出现工作记忆损害。不同品系、不同月龄的αS TG 小鼠，以及不同的工作记忆行为学研究范式，都会对实验结果产生影响。考虑到工作记忆障碍呈现明显的年龄依赖性［21］，后续研究有必要使用不同月龄的αS TG小鼠来模拟PD 发病的各个时期，系统比较其工作记忆损害的时间特性。

社交认知障碍是一种常见的认知障碍，可出现在PD病程的各个阶段［22-23］。本研究利用三箱社交试验检测了早期PD 模型小鼠的社交及社交记忆能力，结果表明6 月龄A53T αS TG 小鼠的社交能力正常，但出现社交记忆损害。与本项工作的研究结果一致，Magen 等［24］利用三箱社交行为学方法研究了Thy1-aSyn（Thy1 启动子驱动人野生型αS基因过表达）TG PD 小鼠模型的社交认知行为，结果表明，Thy1-aSyn 小鼠表现出进行性的社交认知功能损害；3～4 月龄Thy1-aSyn 小鼠尚未表现出社交认知障碍，而7～8 月龄Thy1-aSyn 小鼠则表现出显著的社交认知功能下降。Stanojlovic 等［25］同样在 A53T αS TG 小鼠模型中观察到年龄依赖性的进行性社交记忆损害。今后可进一步使用不同月龄的A53T αS TG 小鼠，研究其社交认知障碍在不同时间点呈现的进行性特点。

目前，PD 认知障碍的神经机制尚不清楚，可能与皮层中αS 免疫阳性路易小体相关［26］。本研究通过免疫组化和免疫荧光共染实验发现，6 月龄A53T αS TG 小鼠脑内皮层神经元内出现αS 病理性包涵体，提示可能与其社交认知障碍相关。进一步研究表明，6 月龄 A53T αS TG 小鼠脑内皮层区 PLK2 的表达水平上调，提示PLK2 活性提高，促进皮层中αS 的磷酸化和异常聚集，导致皮层神经元内出现αS 病理性包涵体。A53T αS TG小鼠社交认知障碍的神经机制尚需深入研究。

综上所述，本研究表明A53T αS TG PD 模型小鼠早期出现社交认知障碍，进一步验证了该模型可作为研究PD 非运动症状的动物模型，提示社交认知损害可能是早期PD 认知障碍的临床预测指标，有望发展成PD早期诊断的标志物。