金华市中心医院碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌药物敏感性及流行病学研究

杨姗姗，应华永，方寅飞，卜黎红

0 引言

以肺炎克雷伯菌为主的肠杆菌科细菌是引起医院感染的重要病原菌之一，可引起呼吸道感染、尿路感染和血流感染等。近年来，肺炎克雷伯菌的耐药形势非常严峻，我国CHINET(中国细菌耐药监测网)数据显示，肺炎克雷伯菌对亚胺培南或美罗培南的敏感性已经由2010年的90.8%下降到2018年的73%(http://www.chinets.com/Chinet)。碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌(Carbapenem-resistantKlebsiellapneumoniae，CRKP)的出现给临床抗感染治疗带来了极大的挑战，感染患者死亡率超过50%，已引起全球广泛关注[1-2]，美国CDC更是将其列为紧急威胁 (http://www.cdc.gov/ drugresistance/threat- report-2013/)。本研究对金华市中心医院分离的碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌的流行情况及耐药机制进行了详细研究，以期为临床抗感染的合理用药及感控预防措施的制定实施提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源 收集2019年7-11月金华市中心医院临床分离的碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌(对亚胺培南、美罗培南或厄他培南任一耐药者)。采用法国梅里埃VITEK 2 Compact全自动微生物鉴定系统及MALDI-TOF质谱仪进行菌种鉴定并剔除重复菌株。大肠埃希菌ATCC 25922为药敏试验质控菌株。

1.1.2 仪器与试剂 定制96孔微量药敏板及阳离子调节肉汤为Thermofisher公司产品；MH琼脂及亚胺培南纸片为英国OXOID公司产品；碳青霉烯酶表型检测缓冲液为上海原科实业发展有限公司生产；TaKaRa TaqTMHS Perfect Mix、6×Loading Buffer、DL2000 DNA Marker等PCR试剂为宝生物工程(大连)有限公司生产。基因扩增引物、琼脂糖为上海生工生物工程技术有限公司产品。Sensititre AIM自动菌液加样系统购自Thermofisher公司，PCR扩增仪购自Applied Biosystems公司，琼脂糖凝胶电泳系统和全自动凝胶成像分析系统购自美国Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 药敏试验 采用微量稀释法进行药敏试验。多黏菌素及替加环素结果根据欧洲抗菌药物敏感性试验委员会(EUCAST)标准进行判读，其他抗生素药敏试验结果判断参照美国临床与实验室标准化协会(CLSI) 2019年标准。采用WHONET5.6软件进行药敏数据分析处理。

1.2.2 耐药表型检测 参照Tsakris等[3]建立的方法及碳青霉烯酶表型检测缓冲液说明书对耐药菌株的碳青霉烯酶表型进行检测。按照K-B法准备细菌涂布平板，然后在平板上贴4张亚胺培南纸片(10 mg)，在4张纸片上分别加乙二胺四乙酸、硼酸、乙二胺四乙酸+硼酸、空白液试剂。于次日根据抑菌圈直径判断耐药表型。滴加乙二胺四乙酸纸片抑菌圈直径较空白试剂纸片增大5 mm以上，提示细菌产B类碳青霉烯酶(如NDM)；滴加硼酸纸片抑菌圈直径较空白试剂纸片增大5 mm以上，提示细菌产A类碳青霉烯酶(如KPC)；当滴加一种试剂较空白无明显抑菌圈增大，滴加乙二胺四乙酸及硼酸纸片抑菌圈直径较空白试剂纸片增大5 mm以上，提示细菌同时产A类和B类碳青霉烯酶。

1.2.3 耐药基因检测 采用煮沸裂解的方法制备细菌DNA模板。PCR法检测常见碳青霉烯酶基因(blaKPC、blaNMC、blaIMP、blaGIM、blaVIM、blaGES、blaIMI、blaSME、blaNDM、blaOXA-48)、ESBLs基因(blaVEB、blaPER、blaTEM、blaSHV、blaCTX-M)和AmpC酶基因(blaMOX、blaCIT、blaDHA、blaACC、blaEBC、blaFOX)。引物序列及反应条件均来源于参考文献[4-6]。PCR扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳后，使用全自动凝胶成像分析系统观察结果，阳性扩增产物送上海迈浦生物科技有限公司进行DNA测序分析，并与GenBank中的序列进行对比，确定具体基因亚型。

1.2.4 多位点序列分型(Multilocus sequence typing，MLST) PCR扩增肺炎克雷伯菌的7个管家基因(gapA、infB、mdh、pgi、phoE、rpoB和tonB)并测序，所得序列上传MLST数据库比对，最终获得肺炎克雷伯菌的序列型(Sequence type,ST)。管家基因序列及反应条件均来源于MLST官网(http://www.pasteur.fr/mlst/Kpneumoniae.html)。

2 结果

2.1 菌株分布 2019年7-11月共收集25株CRKP菌株。标本来源分别为痰液(64%，16/25)、尿液(12%，3/25)、血液(12%，3/25)、腹水(8%，2/25)和胆汁(4%，1/25)。病房分布分别为神经外科病区(48%，12/25)、康复病区(16%，4/25)、肝胆胰外科病区(12%，3/25)、重症监护病区(ICU)(8%，2/25)、神经内科病区(8%，2/25)、肾脏内科(4%，1/25)和急诊外科病区(4%，1/25)。

2.2 药敏试验结果

2.2.1 CRKP菌株对抗菌药的敏感性 CRKP菌株对亚胺培南、美罗培南、氨曲南、头孢哌酮/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦及除外头孢吡肟的其他头孢菌素均全部耐药；对多黏菌素、头孢他啶/阿维巴坦均敏感；对替加环素敏感率为92%，耐药率为4%；对环丙沙星和左氧氟沙星的耐药率分别为96%和84%；对甲氧苄啶-磺胺甲噁唑和阿米卡星的耐药率分别为84%和48%,见表1。

表1 CRKP对临床常用抗菌药物的敏感性

2.2.2 亚胺培南、美罗培南、多黏菌素和替加环素对CRKP的MIC值分布 4种药物对25株CRKP的MIC值分布见图1。亚胺培南和美罗培南对CRKP的MIC分布基本一致，MIC为16～128 μg/ml，其中56%的菌株MIC为128 μg/ml；多黏菌素对96%的CRKP菌株的MIC均为1 μg/ml；替加环素对CRKP的MIC为1～2 μg/ml(图1)。

图1 亚胺培南、美罗培南、多黏菌素和替加

2.3 耐药表型、耐药基因检测结果及MLST分型 经检测，25株CRKP菌株均产丝氨酸酶，未检测到产金属酶表型菌株。PCR结果显示，该丝氨酸

酶为KPC-2型碳青霉烯酶，未检测到其他已知碳青霉烯酶基因。在ESBLs基因中主要检出的为SHV、TEM和CTX-M耐药基因。TEM基因检出率为60%(15/25)，全部为blaTEM-1。SHV基因检出率为100%(25/25)，其中52%(13/25)为blaSHV-12，32%(8/25)为blaSHV-1，blaSHV-11和blaSHV-148分别占12%(3/25)和4%(1/25)。CTX-M基因的检出率为88%(22/25)，blaCTX-M-14、blaCTX-M-9和blaCTX-M-15分别占52%(13/25)、28%(7/25)和8%(2/25)。AmpC酶基因在全部菌株中均未检出。25株CRKP菌株主要以ST11型菌株为主(60%，15/25)，其次是ST290型菌株(24%，6/25)，ST15、ST2118、ST252、ST327型菌株各占4%(1/25)(表2)。

表2 25株CRKP菌株耐药基因分布及MLST分型

3 讨论

对于我院分离的碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌的研究表明，菌株主要耐药机制是产KPC-2型碳青霉烯酶，该结果与国内的其他研究吻合。KPC-2型碳青霉烯酶是目前我国分离的肺炎克雷伯菌中最多见的碳青霉烯酶，而在大肠埃希菌中最多见的是NDM-1型碳青霉烯酶，此外，有关OXA-48家族碳青霉烯酶的报道也逐渐增多。本研究中我们共发现6个MLST分型的CRKP，其中ST11型为主要型，与中国其他地区的报道一致[7-8]；ST290序列型是第2个主要的流行株，该流行株在我国东部地区也屡见报道[9-10]。二者占全部流行株的84%，可见在金华市中心医院发现的流行情况与国内特别是华东地区总体流行情况一致。

神经外科是本次研究中发现的主要的CRKP来源科室，其次为康复科与重症监护病房，3个科室的患者均为颅脑或脊髓损伤性神经病变，CRKP的流行可能与此类患者长期卧床和抵抗力下降有关。我院的院内感染预防控制的重点科室应聚焦于此。此外，我院CRKP主要分离自痰、尿液和血液标本，提示CRKP感染主要见于呼吸道、尿路和血流感染，因此，呼吸机相关性肺炎、导尿管相关性尿路感染等应为CRKP感染的预防重点。

药敏试验结果显示，本院CRKP对多黏菌素和头孢他啶/阿维巴坦敏感性均为100%，其次对替加环素的敏感性为92%，该结果与国内监测数据的结果基本一致[11]。表明多黏菌素、替加环素和头孢他啶/阿维巴坦均可作为CRKP感染的可选择治疗药物之一。多黏菌素类药物是少见的对多种耐药细菌保持敏感的药物，但该药物也存在异质性耐药问题，通常需要与其他药物(如碳青霉烯类药物、替加环素)联合使用，以降低耐药细菌产生[12]。本药具有明显的浓度依赖性，在单药使用时需尽量提高剂量[13]。CRKP对替加环素敏感，但也发现少数细菌对其耐药[11]，为了减少耐药细菌产生，替加环素通常需要与碳青霉烯、氨基糖苷、多黏菌素联合用药[14]。头孢他啶/阿维巴坦是2019年在我国获批新上市的酶抑制剂复合制剂，可用于治疗由肺炎克雷伯菌等细菌引起的复杂性腹腔内感染(cIAI)、医院获得性肺炎(HAP)和呼吸机相关性肺炎(VAP)。本药对产多种碳青霉烯酶(如KPC、OXA-48等)的耐药细菌具有良好的活性，但对产金属型碳青霉烯酶细菌效果不佳[15]，因此，本药在使用前明确细菌耐药表型非常关键。本研究基于亚胺培南缓冲液检测试剂盒，观察酶抑制剂增强试验对CRKP菌株的耐药表型检测效果，结果显示，与通过分子学方法确定的耐药基因型完全一致，提示该方法有望成为实验室检测产KPC型碳青霉烯酶的耐药菌株的一种快速筛查方法，具有操作简单且经济的特点。但由于本研究纳入的菌株数量较少，涉及的碳青霉烯耐药基因较单一，对于该快速筛查方法的特异性、敏感性还有待进一步考察。

综上所述，我院分离的碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌主要以产KPC-2型碳青霉烯酶的ST11型菌株为主，对多黏菌素、替加环素和头孢他啶/阿维巴坦均敏感。我院应重视及加强对神经外科、康复科和重症监护病房消毒、隔离等感控措施，预防CRKP感染。