肠道菌群失调与结直肠癌患者降钙素及免疫球蛋白的关系

李光 朱汉东

胃肠道是人体内重要微生态区，由胃肠道内的微生态菌群、机体免疫调节及胃肠道组织共同组成［1］。正常情况下，菌群、宿主及结构组织3 者之间维持动态平衡，维持微生态平衡［2］；微生态平衡有助于维护肠道免疫屏障，抑制致病菌，降低胃肠道组织炎症病变［3］。肠道菌群失调，有关代谢产物作用于易感性宿主，诱导细胞产生免疫应答反应，进而易引起机体内分泌功能紊乱，增加结直肠癌增殖、转移、扩散的风险，产生不良预后［4⁃5］。血清降钙素原（procalcitonin，PCT）是炎症反应激活的重要指标，在结直肠癌病理发展过程中表达会显著升高。有报道指出，免疫球蛋白G（Immunoglobulin G，IgG）、免疫球蛋白A（Immunoglobulin A，IgA）、免疫球蛋白M（Immunoglobulin M，IgM）在机体抗肿瘤免疫应答中，具有溶解、吞噬靶细胞的作用，是免疫系统的重要组成部分，其含量和功能变化与结直肠癌的发生、发展及预后密切相关。本研究拟分析结直肠癌患者肠道微生态的变化，探讨肠道菌群失调与血清降钙素、免疫球蛋白水平的变化，为临床结直肠癌治疗及预后提供参考。

1 资料与方法

1.1 研究对象及分组

选取2018年6月至2021年6月在武汉市第七医院收治的186 例结直肠癌患者的临床资料。研究组纳入标准：①病理及超声检查确诊为结直肠癌者；②半年内患者未进行抗肿瘤治疗，且均未有肿瘤远处转移者；③配合各项检查，并且临床资料完整者［3，6］。研究组排除标准：①除结直肠癌外，合并其他胃肠道疾病者；②合并肝、肾功能异常或心、脑血管疾病者；③合并免疫系统疾病者；④近1 个月内全身或局部使用过抗菌药物者；⑤合并微生物感染者［3，6］。

根据根据临床体征及肠道菌群检查结果，将186例患者分为肠道菌群失调组（n=64）与正常组（n=122）。肠道菌群失调组患者男37例，女27例；平均年龄（63.35±7.26）岁；，平均病程（3.97±1.54）年。TNM分期Ⅰ～Ⅱ期38 人，Ⅲ～Ⅳ期26 人。正常组患者男70例，女52 例；平均年龄（62.68±8.21）岁；平均病程（4.17±1.62）年。TNM 分期Ⅰ～Ⅱ期74 人，Ⅲ～Ⅳ期48 人。肠道菌群失调组患者I 度菌群失调例35 例，Ⅱ度菌群失调例29 例。两组患者男女比例、年龄、病程及TNM 分期等一般临床资料比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。本研究遵循的程序符合2013年新修订的《世界医学协会赫尔辛基宣言》要求，并且与受试者及其家属签署临床研究知情同意书。

1.2 肠道菌群检测

采用灭菌玻璃棒取患者新鲜粪便1 g，溶于99 mL 灭菌生理盐水中，充分混匀稀释后，将适量稀释液加入MRS 培养基（由江苏康典公司提供）中，严格按照说明书操作，并于37℃条件下培养72 h，通过菌落可数性及形态对肠道双歧杆菌、肠球菌、乳杆菌以及真杆菌的数量进行计数统计。菌群失调评价标准：①细菌数量显著减少，每视野下300～500 个，革兰阳性杆菌比例为40%～50%，革兰阴性杆菌比例为30%，革兰阳性球菌比例少于10%，判定为I 度菌群失调；②细菌数量显著减少每视野下小于300 个，革兰阳性杆菌比例小于30%，革兰阴性杆菌比例小于30%，革兰阳性球菌的比例大于10%，判定为Ⅱ度菌群失调［6］。

参照《肠道菌群失调诊断治疗建议》［7］确定患者的肠道菌群失调确诊标准：①临床体征：出现明显腹胀、腹痛、腹泻甚至发热，或造口排泄量大量增加，且大便颜色呈墨绿色，严重者可导致麻痹性肠梗阻、败血症或感染性休克等合并症出现；合并低蛋白血症时可产生大量腹腔积液。 ②实验室检查：粪便常规检查中发现白细胞明显增多，粪便涂片检查发现球菌杆菌的比例发生失调，对难辨梭状芽孢杆菌毒素进行检测和细菌培养，培养结果为阳性。 ③影像学检查：对患者进行腹部腹盆腔CT或者X 线检查发现肠道存在明显的积气和扩张，肠道内壁可见炎症和水肿甚至可见腹腔积液。符合其中一条或多条则可认为肠道菌群失调。

1.3 观察指标

①比较两组患者肠道双歧杆菌、肠球菌、乳杆菌以及真杆菌的数量。②采集静脉血4 mL，3 000 r/min 离心5 min 后取血清，采用酶联免疫吸附法（enzyme linked immunaosorbont assay，ELISA）检测血清PCT、免疫球蛋白A（IgA）、免疫球蛋白G（IgG）、免疫球蛋白M（IgM）水平；同时采用比色法测定两组患者总蛋白、清蛋白。操作步骤严格按照试剂盒说明书进行，试剂盒均购于美国R&D 公司。

1.4 统计学方法

采用SPSS 21.0 统计学软件进行数据处理；符合正态分布的计量资料采用（）表示，组间比较采用成组t检验；计数资料采用n或%表示，行χ2检验；所有统计学检验采用双侧检验，以P<0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 失调组与正常组患者肠道菌群计数比较

肠道菌群失调组患者双歧杆菌、乳杆菌、真杆菌数量显著低于正常组数量，差异有统计学意义（t=4.743、5.254、5.054，P<0.05）；肠球菌数量明显高于正常组肠球菌数量，差异有统计学意义（t=4.134，P<0.05）。见表1。

表1 失调组与正常组患者肠道菌群计数比较［cfu/g］（±s）Table 1 Comparison of intestinal microflora count between the disorder group and the normal group［CFU/g］（±s）

表1 失调组与正常组患者肠道菌群计数比较［cfu/g］（±s）Table 1 Comparison of intestinal microflora count between the disorder group and the normal group［CFU/g］（±s）

组别肠道菌群失调组正常组t 值P 值n 64 122双歧杆菌6.41±1.05 8.43±0.96 4.743 0.000乳杆菌6.04±0.35 7.85±0.61 5.254 0.000肠球菌7.85±1.06 6.04±0.82 4.134 0.000真杆菌6.11±0.61 8.28±0.42 5.054 0.000

2.2 失调组与正常组患者血清PCT 及免疫球蛋白水平比较

肠道菌群失调患者血清PCT、免疫球蛋白IgG、IgA 及IgM 水平均显著高于正常组，差异有统计学意义（t=5.342、6.453、5.255、7.433，P<0.05）。见表2。

表2 失调组与正常组患者血清PCT 及免疫球蛋白水平比较（±s）Table 2 Comparison of serum PCT and immunoglobulin levels between the disorder group and the normal group（±s）

表2 失调组与正常组患者血清PCT 及免疫球蛋白水平比较（±s）Table 2 Comparison of serum PCT and immunoglobulin levels between the disorder group and the normal group（±s）

组别肠道菌群失调组正常组t 值P 值n 64 122 PCT（ng/mL）7.35±2.13 2.13±1.25 5.342 0.000 IgG（g/L）15.72±1.86 10.12±1.02 6.453 0.000 IgA（g/L）4.17±1.16 2.47±1.21 5.255 0.000 IgM（g/L）2.27±0.83 1.42±0.91 7.433 0.000

2.3 血清PCT、免疫球蛋白水平对患者发生肠道菌群的影响

将发生肠道菌群失调作为因变量，将结果2.2 中PCT、IgG、IgA 及IgM、年龄、性别肿瘤分期作为自变量，纳入多因素logistic 回归模型中采用全变量法进行分析。结果发现，机体中免疫球蛋白血清PCT、IgG、IgA 和IgM 的含量是影响结直肠癌病人肠道菌群失调的独立危险因素（均P<0.05）。见表3。

表3 发生肠道菌群失调的多因素Logistic 回归分析Table 3 Logistic regression analysis of the intestinal dysbacteriosis multiariable

2.4 肠道菌群失调与血清PCT、免疫球蛋白的Pearson 相关性分析

Pearson 相关分析显示，肠道双歧杆菌、乳杆菌及真杆菌数量与患者血清PCT、免疫球蛋白IgG、IgA 及IgM 与呈负相关，而肠球菌数量、菌群失调程度与患者血清PCT、免疫球蛋白IgG、IgA 及IgM 与呈正相关。见表4。

表4 肠道菌群失调与血清PCT、免疫球蛋白的Pearson相关性分析Table 4 Pearson correlation analysis of serum PCT immunoglobulin with intestinal flora disturbance

3 讨论

胃十二指肠主要菌群为乳杆菌、大肠杆菌、类杆菌和梭状芽孢杆菌等，当结直肠发生癌变，组织蠕动节律减慢造成内容物排泄减慢，结直肠内容物长期堆积，细菌滋生，厌氧菌成为优势菌群，此时乳杆菌及类杆菌占据优势［4］，肠道菌群平衡被打破，结直肠癌变、炎症损伤加剧，如此恶性循环加速疾病进展［5］。本研究发现，患者肠道菌群失衡，双歧杆菌、乳杆菌、真杆菌等厌氧菌大量滋生。肠道内类杆菌及梭菌数量急剧增加，导致β⁃葡萄糖醛酸酶活性升高，加快肠内容物氧化水解，进而产生毒性作用，成为肠内源性致癌物［7⁃8］。此外，还有部分菌群可产生β⁃葡萄糖苷酶、偶氮还原酶，促进二甲基肼和亚硝酸盐等致癌物质生成，使得肠道肿瘤恶化转移。肠道菌群失衡后，肠道局部黏膜组织免疫应答及炎性反应均被激活，厌氧菌代谢产生活性氧或有害物质如丙二醛等，会引起DNA 氧化损害和DNA 突变［9⁃10］。

结直肠癌患者菌群失调表示细菌感染导致肠道微生态紊乱；与此同时患者血清PCT、免疫球蛋白IgG、IgA 及IgM 均显著高于正常组，机体PCT、免疫球蛋白代偿性升高，表明免疫功能异常，提示菌群紊乱。本研究多因素回归分析还发现血清PCT、IgG、IgM 和IgA 含量是影响结直肠癌病人发生肠道菌群失调的独立危险因素，这与张帆等人的报道一致［5］。IgG 可以通过与特定的抗原结合，并通过固定补体和结合巨噬细胞充分溶解细菌产生的有害物质、促进机体吞噬作用，也可以促进其他细胞对细菌的杀伤作用；IgM 则可激活补体，通过补体介导促进吞噬作用，加强对细菌的吞噬功能；IgA 是机体黏膜防护的重要因素之一，肠道厌氧均损伤肠道粘膜组织，而IgA 代偿性升高则可减轻粘膜损伤［11⁃15］。

机体遭受细菌等病原菌侵害时细胞免疫及体液免疫随之启动。肠道菌群失调下，肠道双歧杆菌、乳杆菌及真杆菌数量与患者血清PCT、免疫球蛋白IgG、IgA 及IgM 与呈负相关，而肠球菌数量、菌群失调程度与患者血清PCT、免疫球蛋白IgG、IgA 及IgM 与呈正相关。这提示机体炎症反应激活、免疫球蛋白代偿性升高可能与肠道菌群失调有关，肿瘤微环境恶化，厌氧菌侵袭肠道粘膜组织是是患者发生菌群失调的原因之一。

综上所述，结直肠癌患者发生肠道菌群失调与患者血清PCT、免疫球蛋白相关，随着血清PCT、IgG、IgA及IgM水平的增加，可能菌群失调程度更严重。