一株高产虫草素蛹虫草栽培初探

李健 胡志强 杜忠伟 王旭 所玉红 王鑫

(延边朝鲜族自治州农业科学院/国家食用菌产业技术体系延吉综合试验站，吉林 延吉 133000)

蛹虫草(Cordycepsmilitaris(L.)Link)属于子囊菌门(Ascomycota)粪壳菌纲(Sordariomycetes)肉座菌亚纲(Hypocreomycetidae)肉座菌目(Hypocreales)虫草菌科(Cordycipitaceae)虫草属(Cordyceps)，又名北冬虫夏草、北虫草、蛹草菌等，简称蛹草[1]。野生蛹虫草地理分布遍及全世界，在我国四川、云南、西藏、黑龙江、辽宁、吉林、安徽、广东、广西、陕西、河北、湖南、甘肃、湖北、台湾等地均有分布；在国外北美洲、南美洲、欧洲和亚洲等地均有分布[2]。野生蛹虫草主要寄生在林地枯枝落叶中鳞翅目幼虫的茧和蛹上，以及鞘翅目和双翅目等昆虫的蛹、成虫或幼虫上[3,4]。目前，国内外蛹虫草研究方向上的热点为其应用上的研究[5]。

虫草素又称虫草菌素或3′-脱氧腺苷(Cordycepin或3′-Deoxyadenosine)，具有抑菌、抗病毒等生物活性，表现出免疫调节、抗肿瘤、抗衰老、扩张支气管、增强睡眠、显著增强肾上腺素等药理作用功能[6]。天然虫草素主要来源于蛹虫草，蛹虫草中虫草素含量是冬虫夏草的数10倍[7,8]，且人工栽培技术成熟，已逐渐成为冬虫夏草的理想替代品[9]。虫草素价格非常昂贵，目前能以腺苷、3′-O-对硝基苯磺酰基腺苷等为原料进行化学合成[10]。由于虫草素的重要药用价值，目前许多研究通过优化培养基，诱导突变菌种选育使蛹虫草的虫草素产量不断提高[11,12]。虽然通过诱导突变选育出高产虫草素的菌株，但是存在未知的生物安全因素，本文所用蛹虫草为野生采集筛选出来的高产虫草素菌株，安全稳定不易退化。

随着人们对虫草了解的增加，国内外市场的需求也随之增加。由于自然资源的限制，滥采虫草导致市场上的虫草短缺。作为冬虫夏草的替代品，蛹虫草人工栽培已经成熟，但新药研究和保健品开发方面还需深入研究。蛹虫草在抗肿瘤和病毒抑制方面都优于冬虫夏草，因此对其进行研发具有直接的现实意义和较高的经济价值。然而，目前对蚕蛹虫草的活性成分、药理作用和作用机制的研究还很有限。随着研究技术和方法的不断发展，相信蛹虫草会更好、更充分地为人类服务，为人类作出新的贡献。

1 材料与方法

1.1 供试菌种

蛹虫草(Cordycepsmilitaris(L.)Link)菌株由延边叁壹叁生态农业研究所提供。

1.2 主要试剂和仪器

葡萄糖、琼脂、硫酸镁、磷酸二氢钾、75%酒精等均为国产分析纯。上海博迅YXQ-100A立式压力蒸汽灭菌器，太仓华美THZ-C台式恒温震荡培养箱，天津泰斯特DZ-10LⅢ蒸馏水器,上海雷磁JB-3A磁力搅拌器，上海雷磁PHS-3C pH计，苏州安泰SW-CJ-1BU洁净工作台，上海精宏DNP-9272电热恒温培养箱，上海博迅BIC-400人工气候箱，上海博迅GZX-9240MBE电热鼓风干燥箱，常熟双杰JJ223BC分析天平，青岛海尔HYC-390F冷藏冷冻箱。

1.3 PDA培养基

先将马铃薯洗干净削去外皮，再称取马铃薯200g切成条，在锅中加水1000mL，再加入称量好的马铃薯条，煮沸30min，直至马铃薯条被煮烂即可，用多层纱布过滤后滤渣弃去，留取滤液在锅中，再加入琼脂粉20g，待琼脂溶解完后，加入葡萄糖20g，继续加热搅拌均匀，再补水分至1000mL，分装在玻璃试管中大概1/3位置，塞上棉塞，高温高压121℃灭菌30min后取出试管摆放斜面，冷却后贮存备用，pH值自然。

1.4 液体培养基

先将马铃薯洗干净削去外皮，再称取马铃薯200g切成条，在锅中加水1000mL，再加入称量好的马铃薯条，煮沸30min，直至马铃薯条被煮烂即可，用多层纱布过滤后滤渣弃去，留取滤液在锅中，再加入葡萄糖20g、硫酸镁1.0g、磷酸二氢钾1.0g，继续加热搅拌均匀，再补水分至1000mL，分装在三角瓶中大概1/2位置，塞上棉塞，高温高压121℃灭菌30min后取出，冷却后贮存备用，pH值自然。

1.5 栽培培养基

1.5.1 配方1

在栽培瓶中加入糙米50g、蚕蛹50g、水30mL，盖好瓶盖。

1.5.2 配方2

在栽培瓶中加入糙米50g、水70mL，盖好瓶盖。

1.5.3 配方3

在栽培瓶中加入蚕蛹50g，盖好瓶盖。

上述3种培养基配制完成后，高温高压121℃灭菌30min后取出，冷却后贮存备用，pH值自然。

1.6 栽培方法

1.6.1 制备母种

提前将制备好的PDA培养基放在洁净工作台上，用紫外线灯消毒灭菌30min，在酒精灯火焰上方将活化的蛹虫草保留菌种用接种钩取绿豆粒大小移植试管斜面培养基的适当位置，迅速塞上棉塞。将接种好的试管在恒温培养箱中26℃避光培养10d，注意通风并检查菌丝生长情况。

1.6.2 制备液体菌种

提前将制备好的液体培养基放在洁净工作台上，用紫外线灯消毒灭菌30min，在酒精灯火焰上方将活化的蛹虫草母种用接种钩取绿豆粒大小移植到液体培养基中，迅速塞上棉塞。将接种好的液体培养基在立式智能精密摇床中26℃静止培养24h，之后进行悬浮培养转速为110r·min-1，在26℃的条件下避光培养6d，得到液体菌种，将液体菌种用磁力搅拌器打碎后即可用于接种。

1.6.3 制备栽培种

分别制作3种配方培养基各100瓶，高温高压121℃灭菌30min，灭菌结束后将栽培种放在洁净工作台上，用紫外线灯消毒灭菌30min，待培养基冷却后在酒精灯火焰上方接入20mL液体菌种，迅速盖好瓶盖。

1.6.4 出菇管理

将接种好的栽培瓶置于人工气候箱中，在温度22℃、湿度55%～60%条件下避光培养，期间注意检查杂菌情况，按时通风，避免二氧化碳浓度过高。待菌丝体长满整个培养基表面和吃透整个培养基时注意观察培养基表面小隆起形成时间，若培养基表面有小隆起时每天12h需给予400Lux左右的散射光照射，促进转色。在温度22℃、湿度75%条件下继续培养，直至小隆起生长成橘黄色的原基。在原基形成后温度20℃、湿度80%以上、每天12h需给予400～800Lux左右的散射光照射条件下，按时通风，促进原基分化，子座形成后同条件培养，直至子实体成熟。

1.7 采摘送检

当子座长到5～8cm，表面有橘黄色粉状物出现时，即表示虫草成熟可采收。采收时，用竹镊子从栽培瓶内取出虫草，并称取每瓶子实体鲜重，然后在电热鼓风干燥箱中45℃条件下烘干至恒重，称取每瓶子实体干重，并取样品200g送至上海微谱化工技术服务有限公司检测虫草素含量。

2 结果与分析

2.1 蛹虫草栽培记录

通过对3种配方培养基栽培蛹虫草各个阶段记录，见表1，可以看出3种配方培养基在菌丝萌发和菌丝覆盖培养基时的时间差距不大，但在后续生长时间差距较大，配方2与配方3在形成原基时相差10d，形成子实体时相差21d，子实体成熟时相差19d，这可能由于配方3采用纯蚕蛹作为培养基，蛹虫草菌丝不易吃透蚕蛹培养基，导致蛹虫草生长发育缓慢。配方2比配方1和配方3菌丝发育更早、形成原基和子实体更早、成熟更早，这可能由于配方2采用纯糙米作为培养基，蛹虫草菌丝容易吃透蚕蛹培养基，导致蛹虫草生长发育较快。

表1 蛹虫草栽培记录

从图1可以看出，3种配方培养基蛹虫草子座比市面售卖的蛹虫草子座更加扁宽，而且比较稀疏，这可能与此蛹虫草菌株自身特点有关。由于本试验栽培蛹虫草只采收1茬，所以采收较晚，蛹虫草子实体生长已经弯曲不直，可能与采收较晚或人工气候箱光源角度固定有关。3种配方培养基蛹虫草子实体均生长茂密粗壮，颜色呈橘黄色，长势良好，已经成熟可以进行采摘。

图1 成熟蛹虫草子实体

2.2 蛹虫草测产

对3种配方培养基栽培蛹虫草采摘测产取平均值，从表2可以看出，蛹虫草栽培配方1平均干重9.28g，平均鲜重56.76g，干湿比为16%，生物学转化率达到56.76%；配方2平均干重8.38g，平均鲜重53.46g，干湿比为16%，生物学转化率达到106.92%；配方3平均干重8.26g，平均鲜重51.24g，干湿比为16%，生物学转化率达到102.48%。

表2 蛹虫草平均产量及生物学转化率

2.3 虫草素含量检测

根据检测结果可知，配方1培养基栽培蛹虫草虫草素含量为15.63mg·g-1，配方2培养基栽培蛹虫草虫草素含量为21.67mg·g-1，配方3培养基栽培蛹虫草虫草素含量为13.76mg·g-1，台湾桃园虫草虫草素含量为0.34mg·g-1。配方1和配方2培养基栽培蛹虫草虫草素含量相差最大为6.04mg·g-1，3种配方培养基栽培蛹虫草虫草素含量区别不大。配方2培养基栽培蛹虫草虫草素含量与对照组台湾桃园虫草虫草素含量相差最大为21.33mg·g-1，大约是对照组台湾桃园虫草虫草素含量的64倍。

表3 虫草素含量检测结果

3 讨论

本试验利用3种配方培养基对蛹虫草进行栽培比较试验，结果3种配方培养基栽培的蛹虫草质量无明显区别，但糙米培养基生物学转化率更高，栽培的蛹虫草菌丝发育更早、形成原基和子实体更早、成熟更早，且糙米加水培养基所栽培蛹虫草虫草素含量最高，是对照组台湾桃园虫草虫草素含量的64倍，在实际生产中使用糙米加水培养基可降低成本，可作为今后商品化、工厂化栽培生产蛹虫草提取虫草素的首选培养基大力推广应用。

本试验采收蛹虫草子实体较晚，且只采收1茬，生长出的蛹虫草子实体子座比市面售卖的蛹虫草子座更加扁宽，而且比较稀疏，这可能与此蛹虫草菌株自身特点有关。本试验虽然将此蛹虫草菌株成功栽培，且虫草素含量较高，但此蛹虫草菌株还是易退化，这与宋金俤等[13]的研究相一致，保持菌种活力还需要进一步的研究。张红等[14]采用60Co-γ射线辐射诱变蛹虫草菌株虫草素含量达9.6mg·g-1，李文等[15]采用低能离子束注入蛹虫草，筛选突变菌株虫草素含量11.92mg·g-1，温鲁等[16]研究航天搭载蛹虫草的虫草素含量16.40mg·g-1，本试验测得糙米加水培养基栽培蛹虫草虫草素含量为21.67mg·g-1，都明显高于其他物理化学等诱变方式，提高蛹虫草虫草素含量。因此，具有较大研究价值，仍有待于进一步研究。