完全性骶髓损伤后大鼠神经源性膀胱模型的制备与观察

脊髓损伤(spinal cord injury, SCI)是指由于外界直接或间接因素导致脊髓损伤。流行病学研究表明，近年来随着社会经济的发展，SCI的发生率在世界范围内呈逐年上升的趋势，其中，亚洲人脊髓损伤发病率近些年已从每百万人12.06人的发生率上升到61.6人

。神经源性膀胱(neurogenic bladder, NB)是SCI后最常见的并发症，以骶髓损伤为例，NB功能障碍表现为逼尿肌收缩强度或持续时间降低即逼尿肌无反射或低反射，膀胱排空时间延长或排空不能，残余尿量增多，临床表现为尿潴留。这种排尿困难和高压储尿状态是并发膀胱-输尿管反流、肾功能损伤等上尿路疾病的主要原因，严重降低了患者的生存质量

。SCI所致的NB是临床与实验研究的重点和热点内容之一，然而，目前绝大多数的实验及动物模型研究主要集中在骶上水平，选择骶髓水平损伤的实验及动物模型研究较少，且现有的研究造模方法不统一、缺少脊髓损伤术后的系统护理说明以及模型稳定性的判定

。因此，对脊髓骶髓水平损伤的动物模型进行系统研究就显得十分必要。本实验选取大鼠为实验对象，采用脊髓完全横断术成功复制骶髓损伤后大鼠神经源性膀胱模型，汇报如下。

1 材料与方法

1.1 动物与分组 SPF级健康SD雌性大鼠42只，体质量250～280g，湖南中医药大学动物实验中心提供(动物许可证号：SCXK(湘)2016-0002；实验设施实验许可证号：SYXK(湘)2013-0005)，24～26℃的安静环境中适应性喂养3周。适应性喂养后采用随机数字表法编号，随机抽取12只设为空白组，剩余30只大鼠采用改良Hassan Shaker脊髓横断法制作成完全性骶髓损伤后神经源性膀胱模型。实验过程对大鼠的处置方式严格按照中华人民共和国科技部2006年发布的《关于善待实验动物的指导性意见》。

我国企业虽然建立了股东会、董事会、监事会三权制衡的内部治理结构，但企业的产权归国家所有，所有者地位的缺失造成企业管理当局权利的高度集中。同时，国有企业的股权比较集中，国有股一股独大，股权过于集中容易损害非控股股东的利益，控股大股东经常操纵股东大会、董事会、监事会，且集控制权、执行权、监督权于一身，权利较大，其他股东没有办法来约束它。他们这些人为了少数人的利益，极有可能向外界提供虚假的会计报告。

1.2主要材料、试剂与仪器 主要材料、试剂：水合氯醛(国药集团化学试剂有限公司)，青霉素钠(哈药集团制药总厂)，4%多聚甲醛(上海威奥生物科技有限公司)，乳酸盐林格溶液(哈药集团制药总厂)，橡皮生肌膏(湖南中医药大学第一附属医院自制药)，其余常规试剂(上海国药生物)。主要仪器：微量注射泵(浙江史密斯医学仪器有限公司/WZ-50C6)，F3导尿管(上海康鸽)，16通道生理记录仪(美国BIOPAC公司/MP150-WSW)，YP10002小动物电子秤(上海佑科仪表有限公司)，显微镜(厦门麦克奥迪)，摇床(其林贝尔)，恒温箱(北京六一)，切片机(浙江金华益迪试验器材)，包埋机(常州中威电子仪器)。

1.3 方法

1.3.1 手术方法 采用改良Hassan Shaker脊髓全断法进行模型制备

，大鼠术前24h禁食不禁水，术前2h腹腔注射20U单位抗生素预防感染；随即以10%水合氯醛腹腔注射麻醉后(300mg/kg)，俯卧位捆绑固定、备皮、消毒；于L

～L

椎间隙处完全横断脊髓，损伤大鼠脊髓S

节段

；具体为：于鼠背部皮肤相应位置以手术刀沿后正中线作3cm的纵向切口；逐层钝性分离筋膜、肌肉暴露L

椎体棘突及椎板，去除L

棘突和椎弓根以充分暴露脊髓，注意避免邻近神经等组织损伤。选用5号牙科钩平口探头端沿椎管一侧下缘穿过脊髓底部，用手术刀完全切断脊髓，确保无神经纤维残留。手术过程严格无菌操作，确认止血充分后由内而外逐层严密缝合创面。成模标准

：①大鼠脊髓休克期后，后肢运动功能障碍且膀胱功能障碍表现为尿潴留；②尿流动力学检测：漏尿点压力(leak pointpressure, LPP)降低、膀胱最大容量(maximum cystometric capacity, MCC)增加，膀胱顺应性(bladder compliance，BC)增加，满足以上即可判断成模。剔除标准：术后存在自主排尿、尿失禁，或出现严重尿血、尿路感染、自噬、腹胀等并发症的大鼠予以剔除。

图1所示为杨庄东街4个信号交叉口路段的道路结构、道路渠化和周边交通需求产生情况等. 从图1中可以看出，该道路周边聚集有大量生活社区，交通需求非常大.

1.3.2 术后护理 ①术后大笼单笼饲养大鼠，保证大鼠充分的活动空间；②予抗生素预防感染(术后1～3d，20U单位青霉素酸钠2次/只/d；术后4～7d给予20U单位1次/只/d)；③预防电解质失衡(手术当天及第2天予大鼠乳酸盐林格溶液皮下注射，20ml/kg，2次/d)。④予苦味酸皮肤喷喷洒预防自噬，出现自噬者及时采取创面消毒包扎处理，并予青霉素钠预防感染。⑤肠道并发症预防：手术当天仅予葡萄糖喂养；术后2～7d，葡萄糖加少量饲料喂养(约10g/d/只)，7d后常规喂养，出现腹胀者，减少饲料喂养并适当补充葡萄糖，温和按揉腹部，更换大笼饲养，保证其活动范围。⑥膀胱护理：以crede手法排尿，3次/d，避免膀胱尿液长期大量潴留膀胱造成肾、膀胱的功能损伤，若出现血尿及尿路感染等，予腹腔注射青霉素钠(20万u/只/d)持续治疗。

1.3.3 分组处理 空白组大鼠适应性喂养后常规饲养18 d，于第19天行尿流动力学检测，断颈处死后剪取膀胱组织，以备HE染色后光镜下进行形态学观察。模型组大鼠适应性喂养后予以手术造模，造模术后每日采取规范化的术后护理，观察并记录大鼠膀胱残余尿量、并发症等情况，待第19天大鼠生命体征稳定、并发症良好控制，将大鼠随机分为3组，每组10只，分别于造模术后第19天、23天、28天行尿流动力学检测，比较成模后不同阶段模型大鼠的膀胱功能状况。

1.4 评定标准

2.2.2 大鼠尿流动力学检测结果 尿流动力学检测结果显示：与空白组相比较，模型组大鼠膀胱LPP降低，膀胱MCC、BC增加(

<0.01)。见表2。

1.4.2 尿流动力学检查方法 采用膀胱造瘘法行膀胱尿流动力学检测

：测试前将16通道生理记录仪、F3导尿管及微量注射泵以三通管相连，确保系统密闭相通，充盈导尿管、确保管道中无气泡影响，测试系统调零后备用。大鼠充分麻醉后固定于仰卧位，手法排除膀胱内残余尿液后下腹部消毒备皮。于下腹正中做长约2cm的纵行切口，暴露膀胱顶，将备好的F3导管经膀胱顶造瘘处插入后以外科缝合线严密缝合，确保缝合严密后逐层缝合腹部肌肉皮肤以恢复腹腔密闭环境。打开检测系统持续观察，得到的稳定压力即为膀胱的基础内压，之后打开微量注射泵，灌注温生理盐水(水温25～35℃，速度6ml/h)

。持续记录膀胱压力变化曲线，并观察膀胱最大容量、漏尿点压力、膀胱顺应性等数值：①LPP为出现首次漏尿时膀胱内压力；②MCC为出现首次漏尿时的时灌注容积，即灌注速度(mL/min)×灌注时间(min)；③BC为膀胱容量变化值与膀胱压力变化值相比求出大鼠膀胱顺应性。

对韩城区块3层主力煤层排采井网进行规划，已经实施的开发井主流井距为280～350 m，南北向排距大于东西向井距的菱形井网。压裂时通过微地震监测及稳定电场井间监测表明，压裂缝呈椭圆状分布，主裂缝延北东方向延伸，裂缝半长为80～175 m，在短轴方向的裂缝半长为50～85 m。压裂井与邻井井间距300 m以上，2口井方位垂直于最大主应力方向，压裂基本不能波及邻井。压裂井、邻井方位与主应力方向呈60°～180°，波及邻井的几率比较大。

2.3 造模术后第19、23、28天模型A、B、C组尿流动力学检测结果比较 模型组大鼠行造模手术后第19天、23天、28天尿流动力学检测结果显示：3组间大鼠膀胱LPP、MCC及BC比较其差无统计学意义，见表3。

2 结果

空白组大鼠第19天尿流动力学检测过程中死亡1只，模型组大鼠护理期间死亡3只，并于第23天、28天行尿流动力学检测过程中各死亡1只，最终共计36只大鼠纳入统计学分析。

2.1 实验大鼠基本情况

2.2.1 逼尿肌组织镜下观察 HE染色后结果显示，空白组大鼠膀胱逼尿肌呈正常形态结构，肌束排列紧致、肌纤维饱满、排列整齐，间质填充少；造模术后第19天，模型组大鼠逼尿肌肌束排列紊乱、肌纤维严重萎缩、间质结构填充多。见图1。结果提示：大鼠骶髓损伤后逼尿肌失神经支配，适应性地出现病理性改变。

2.1.1 一般情况 空白组大鼠一般情况良好。模型组大鼠造模术后出现双侧后肢运动功能障碍，体重减轻；术后模型组大鼠膀胱功能障碍持续表现为尿潴留，触诊下腹部可见膀胱充盈胀大，刺激腹壁(术后早期)/提尾悬空(术后晚期损伤愈合)无自主排尿。模型组大鼠行造模术后每日予3次手法排尿，4周护理期间，模型组大鼠平均单次手法排尿量、每日手法排尿总量分别为3ml及9ml左右。

新年的钟声已经敲响。此时此刻，我谨向全国水利系统广大干部职工致以诚挚的问候和新年的祝福！向关心支持水利改革发展的社会各界人士表示衷心的感谢和美好的祝愿！

2.1.2 模型组大鼠并发症发生情况 模型组大鼠死亡3只(10.00%)，血尿8只(26.67%)，自噬2只(6.67%)，腹胀2只(10.00%)，尿路感染3只(10.00%)。通过4周的系统观察和护理，模型组大鼠18d后生命体征保持稳定，且并发症得到良好控制。术后8d内出现并发症的高峰期，术后13～18d出现第2个并发症的高峰期，第2个高峰期并发症发生较第1个高峰期减少，随后大鼠无新增并发症，情况稳定。见表1。

2.2 造模术后第19天模型A组大鼠逼尿肌组织与尿流动力学观察

在这四层阅读层次的介绍中，作者重点介绍了分析阅读与主题阅读的方法，这两种层级的阅读更具技巧性，也更让我们获益，我们具体来回顾一下这两个层级的阅读的方法和收获。

①统计两组患者的血糖控制效果，包括护理前和护理后的空腹血糖（FBG）、餐后2 h血糖（2 hPG）和糖化血红蛋白（HbAlc）；②统计两组患者的并发症发生情况，以甲亢危象、酮症酸中毒、低血糖等并发症发生率进行评估。

1.4.1 一般情况观察 一般行为学观察：记录大鼠饮食饮水等一般情况。记录大鼠血尿、自噬、腹胀、死亡等情况。大鼠尿量观察、记录：空白组、模型组大鼠提尾，观察是否存在自主排尿的情况，触诊大鼠下腹部膀胱位置是否膨隆，存在尿潴留的表现。

1.4.3 光镜标本制作 病理形态学观察：苏木精-伊红染色法(hematoxylin-eosin staining，HE)染色后，光镜下观察各组病理切片膀胱逼尿肌形态变化。具体操作步骤：大鼠膀胱逼尿肌标本于4%多聚甲醛中固定48h，石蜡包埋后切片于60℃下烤片1～2h，经二甲苯中脱蜡2次(10min/次)，乙醇洗蜡(100%/95%/85%/75%乙醇每级放置5min)，蒸馏水洗5min后苏木素染5～10min，蒸馏水复洗，经PBS返蓝、伊红染3～5min、蒸馏水洗后予酒精梯度脱水(95%～100%每级5min)，二甲苯透明2次(10min/次)后中性树胶封片，最后光镜下观察膀胱逼尿肌的组织形态学改变。

3 讨论

SCI后的NB是脊髓损伤患者严重的并发症，围绕脊髓损伤后NB的康复研究是近年来临床和实验研究的热点

。脊髓圆锥作为排尿反射的低位中枢，其受损可导致排尿反射弧中断，逼尿肌反射消失，继发逼尿肌的收缩能力下降，临床表现为尿液充盈膀胱后不能正常排出，引起膀胱容积增大、顺应性降低，最终表现为排尿困难、尿潴留为主要特点的神经源性膀胱功能障碍。此类膀胱储尿和排尿功能均受到严重损害，残余尿量多，尿路感染率高达83%，极易引起肾脏损害

。目前，对于脊髓损伤后NB的绝大多数的动物模型研究都集中在骶上水平，对于骶髓水平损伤的临床及实验研究较少。

选择横断大鼠脊髓骶髓水平需要考虑到其神经控制系统及其脊髓骶段解剖位置与人体的差异性。膀胱的低级神经中枢主要为交感神经、副交感神经。其中交感神经支配膀胱顶部、颈部以及尿道，松弛逼尿肌和紧张尿道括约肌以达到贮尿目的。副交感神经兴奋则膀胱逼尿肌紧张尿道括约肌放松，使尿液排出。副交感神经低级中枢位于骶段S

水平，对应大鼠椎体L

的任意部位。建立骶段完全性损伤可选择横断大鼠L

椎体下的脊髓，该段受损后即可造成骶副交感神经骶-膀胱丛抑制，继而出现逼尿肌收缩无力从而产生尿潴留

。本实验参考相关研究选取大鼠L

椎间隙下的脊髓进行横断

，结果显示：术后第18天模型组大鼠光镜下逼尿肌肌纤维萎缩、兼间质结构填充增多、排列紊乱；尿流动力学检测结果可见模型组大鼠膀胱漏尿点压力显著降低，膀胱容量、膀胱顺应性增加，逼尿肌收缩无力，漏尿点压力降低，尿液潴留，膀胱容量增大。形态学改变及尿流动力学检测结果与相关研究结果一致，证实模型复制成功

。

脊髓损伤后的各种并发症的发生率高，良好地控制并发症对于保证动物模型质量十分重要。本实验中我们观察到大鼠后1～8d、13～18d分别出现了并发症的高峰期，因脊髓横断术本身的创伤及术后脊髓休克期所致的运动系统及各内脏功能的障碍导致了第一期并发症的高峰，之后大鼠术后创伤基本修复，部分大鼠脱离脊髓休克期，神经功能得到一定程度的恢复，并发症发生率随之降低。从并发症的发生率来看，血尿和尿路感染的综合发生率高达36.67%，占并发症总发生率53.34%的一半以上，早期的护理方案主要采用Crede手法排尿，避免膀胱过度充盈后出现血管的破裂，本实验中，除了规律的手法排尿之外，同时规律地控制大鼠的饮水，将二者结合起来(分三次排尿、饮水，给水约10ml/次/只)，与前期研究相比较，进一步降低了并发症的发生率

。在脊髓休克期期间，采用常规饮食的方法，大鼠不能自主控制进食量，常因过量进食导致腹泻、腹胀等较为严重的肠道并发症，故本实验在早期减少大鼠常规进食量，适当补充葡萄糖水以减小胃肠消化负荷，待大鼠脊髓休克期结束、运动功能提高后，逐渐恢复其常规饮食。本研究中，肠道并发症的发生率仅为10%。

2.2.2 大小比数 大小比数被定义为胸径大于参照树的相邻木占n株最近相邻木的株数比例，用以描述林木个体大小分化程度，或树种的生长优势程度(描述非均一性)，其表达式 式中：Ui为参照树i的大小比数；n为最近相邻木的株数；kij为离散性变量，其值定义为，当参照树i比相邻木j大时，kij=0，否则kij=1。大小比数量化了参照树与其相邻木的关系，其值Ui越低，说明比参照树大的相邻木越少式中：U为树种或林分平均大小比数；N为树种或林分的林木总株数。

目前对于骶髓损伤后NB膀胱大鼠模型成功的判定并无确切的标准，骶段脊髓损伤后大鼠在脊髓休克期以及脊髓休克期后，膀胱功能障碍均表现为尿潴留状态，客观上为模型成功与否的判定带来了一定的困难。采用形态学、尿流动力学等客观的检测方法，结合大鼠膀胱功能的表现(如：尿液潴留触诊可见膀胱胀大、大鼠提尾悬空不能自主排尿)可以准确地判断模型成功与否。然而在实际的实验研究中，采用尿流动力学检测的方法需要特定的仪器，且对膀胱功能造成一定的影响，如本实验中选用造瘘的方法行尿流动力学检测则存在创伤较大、操作难度高、难以重复进行等局限。对此，本实验对完全性骶髓损伤所致的大鼠NB模型进行了长达4周的系统观察，结合膀胱功能临床观察、尿流动力学检测，并总结出判断模型成功的简便参考标准，即：大鼠骶髓损伤术后18天度过脊髓休克期，此时触诊大鼠下腹部，若连续2天出现膀胱胀大，大鼠提尾悬空后若不能自主排尿，可以确定模型制备成功。

总之，本研究采用改良的脊髓横断法于大鼠第L

腰椎间隙进行横断，术后进行规范化的护理，较好地控制并发症，并采用膀胱尿流动力学检测及膀胱逼尿肌形态学观察的方法进行验证，成功地复制了骶髓损伤后神经源性膀胱大鼠模型，为后续的动物实验研究提供了有益的参考。

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