肝部分切除术后血清IL-24上调与肝再生相关性研究*

刘 晗，周 虹，李玥璐，狄滨茹，李薪宇，林 庆

(西南医科大学：1.临床医学院；2.基础医学院生物化学与分子生物学教研室；3.麻醉学系，四川 泸州 646000)

肝再生是动物体内最神秘、最迷人的现象之一。肝切除(70%)或肝损伤后[1]，其特点是恢复迅速。研究发现，肝部分切除术(PHx)后，细胞因子白细胞介素-6(IL-6)在24 h内的表达明显高于对照组。在过表达IL-6的小鼠中没有发现肝细胞增殖增强，但IL-6基因敲除小鼠在PHx后肝再生被延迟。这表明IL-6是肝脏再生所必需的，但并不启动肝再生[2]。

近年来，有报道称IL-10、IL-22等细胞因子在肝脏再生的初始阶段发挥重要作用。研究发现，肝脏局部产生IL-22可以促进肝细胞的增殖，但肝脏更容易发生肿瘤。IL-22对肝脏的炎症无明显作用。这些发现可能为临床实践中预测肝脏相关手术的预后提供线索[3]。

IL-24是IL-10家族细胞因子的新成员。IL-24在正常人黑素瘤细胞中的表达高于转移性黑素瘤细胞。黑色素瘤分化相关基因-7/IL-24(mda-7/IL-24)是一种在体外或体内临床前动物模型中显示广谱抗癌活性的多功能细胞因子[4]。在生理条件下，IL-24主要由活化的单核细胞和T2辅助细胞分泌，而IL-24的主要靶向组织根据受体的表达模式，在起源上是非造血组织，包括皮肤、肺和生殖组织[5-6]。IL-24在肝损伤的发展过程中发挥着重要的保护作用，可能用于肝损伤的治疗。IL-24对肝细胞的保护作用主要依赖于IL-20R1[7]。IL-22受体的α1亚基(IL-22RA1)只允许IL-20和IL-24信号传导。IL-20RA和IL-22RA1在某些组织中的表达受到限制，但IL-22RA1在皮肤、胰腺、肝脏、肾脏和肠道中高表达[5-6]。此外，IL-24作为IL-22R的配体，可促进糖尿病db/db小鼠的创面愈合[8]。

1 材料与方法

1.1动物 雄性C57BL/6小鼠(8周，15～20 g)购自南京大学模型动物研究中心(中国南京)。动物的使用得到了西南医科大学动物关爱伦理委员会(中国四川)的批准。实验动物共纳入105只，随机分为3组，分别为PHx组、对照组、假手术组，每组35只。对于70% PHx动物用1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，然后结扎并切除中、左肝叶，如前所述[9]。假手术时，打开腹腔，轻轻按摩肝脏，不切除。在手术后的不同时间点，每组随机选取5只小鼠被实施安乐死，肝脏被取出并在10%磷酸盐缓冲液(PBS)或福尔马林中固定。2/3 PHx最常用于啮齿动物和大型动物，因为其是主要的再生刺激，引起残余肝脏的同步和均匀反应。为了测试IL-24在再生肝中的功能相关性，对小鼠进行了2/3 PHx。

1.2方法

1.2.1蛋白质印迹法 将小鼠组织在Triton裂解缓冲液(20 mmol/L Tris，pH 7.4，137 mmol/L 氯化钠溶液，10%甘油，1%Triton X-100，2 mmol/L EDTA，1 mmol/L PMSF，10 mmol/L 氟化钠溶液，5 mg/mL抑肽酶，20 mmol/L 亮肽酶和1 mmol/L 原钒酸钠)中裂解，并在4 ℃，以12 000 r/min离心15 min。使用BCA测定法测量上清液的蛋白质浓度。将蛋白质样品用4×十二烷基磺酸钠(SDS)上样缓冲液[200 mmol/L Tris，pH 6.8，8% SDS，400 mmol/L 二硫苏糖醇(DTT)，0.4%溴酚蓝，40%甘油]在100 ℃下变性5 min，并进行标准SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和如前所述蛋白质印迹分析[10]。

1.2.2定量即时逆转录PCR(q-PCR) 进行半定量即时逆转录PCR(sq-PCR)和q-PCR。在指定时间点取标本，应用q-PCR检测IL-24 mRNA水平，采用q-PCR检测IL-20R2 mRNA。根据制造商的说明，用TRIzol试剂(Invitrogen，Thermo Fischer，USA)分离总RNA。根据制造商的协议，使用M-MLV逆转录酶(美国Promega)进行逆转录反应。sq-PCR通过在1%或4%(对于XBP1)琼脂糖凝胶上运行产物来进行。如前所述，qPCR分析使用SYBR预混料Ex Taq(日本Takara)进行[10]。用18S对结果进行统一化，并使用2-ΔΔCq方法进行定量[11]。引物如下：mouse IL-24,forward:5′-TCTGCGTGTAAGTTCCGAGT-3′,and reverse:5′-GAGAACCACCCCTGTCACTT-3′;mouse IL-20R2,forward:5′-GTCTGGACAA GTCCGTTCATG-3′,and reverse:5′-GCTTCATGTTG GTTGACTGTAC-3′;mouse 18S,forward:5′-CGGCTACCACATCCAAGGAA-3′,and reverse:5′-GCTGGAATTACCGCGGCT-3′。

1.2.3组织学分析 将小鼠的肝组织在室温下固定在4%福尔马林中至少24 h，嵌入石蜡中，并切成5 μm切片。将肝脏切片去蜡化并用苏木精和伊红(HE)染色以进行形态学分析。通过增殖细胞核抗原(PCNA;CST 2586S)免疫染色，如前所述[12]。

2 结 果

2.1mIL-24-Fc融合蛋白诱导角质形成细胞增殖 根据IL-22RA1在上皮细胞和肝脏中均有高表达，将mIL-24-Fc或PBS注射到小鼠皮内。HE染色显示2组小鼠表皮组织厚度不均匀。2组小鼠均有单层或多层角质形成细胞，1层或2层是最薄的。mIL-24-Fc组和PBS对照组表皮最厚部位如图1所示。PBS对照组在表皮组织最厚的部分有3～4层角质形成细胞，而mIL-24-Fc组在表皮组织最厚的部分有5～6层角质形成细胞，增厚的表皮覆盖范围更广。

图1 注射PBS和mIL-24-Fc小鼠皮下石蜡切片(HE染色)

2.2PCNA 通过PCNA染色评估肝再生，PHx后12、48 h肝脏再生显著增强(图2A)。但在3、12、48 h，假手术组的肝再生情况相比PHx组并不明显。因此，PHx小鼠肝质量的恢复机制可能与肝细胞增殖有关。

2.33组谷草转氨酶(AST)和谷丙转氨酸(ALT)水平比较 PHx组、假手术组和对照组分别于3、12、48 h测定血清AST和ALT水平。结果发现，在上述3个时间点，3组的AST和ALT水平均远高于对照组。ALT和AST在12 h达到峰值,而ALT和AST水平在48 h低于3 h和12 h。然而,假手术组在3、12、48 h的ALT和AST水平低于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)。见图2B、C。

A.对照组(上)、假手术组(中)和PHx组(下)分别在3 h(左)、12 h(中)和48 h(右)进行PCNA染色。B、C分别为对照组、假手术组和PHx组的ALT和AST水平(n=5)。与对照组比较，aP<0.05。图2 肝部分切除术小鼠模型的建立

2.4肝细胞IL-24 mRNA PHx组和假手术组在3 h时IL-24 mRNA水平均略有下降，假手术组和对照组在12 h时的IL-24 mRNA表达水平相同。然而，PHx组在12 h时IL-24 mRNA的表达水平高于对照组和假手术组。PHx组在48 h时IL-24 mRNA水平显著升高(图3A)。经PCNA检测，48 h时肝细胞增殖明显增强。因此，推测IL-24通过IL-20R2受体的未知信号通路或非受体方式的信号通路刺激肝细胞增殖。

A、B.q-PCR检测对照组、假手术组和PHx组在3、12、48 h肝脏中IL-24和IL-20R2 mRNA的转录情况(n=5)。与3、12 h比较，aP<0.05；与假手术组比较，bP<0.05。图3 IL-24与小鼠肝切除后肝细胞增殖相关

2.5IL-20R2 mRNA PHx后IL-20R2 mRNA水平持续升高，在PHx小鼠3、12、48 h诱导IL-20R2基因转录。然而，假手术组IL-20R2基因在3、12、48 h的转录水平低于PHx组(图3B)。

2.6血清 IL-24 蛋白 在指定时间内用ELISA检测IL-24水平(图4A)。PHx组和假手术组的血清IL-24水平均显著升高，在12 h达到峰值，然后开始下降。这与IL-24 mRNA的变化不一致。结果表明，血清IL-24水平的不同是剖腹手术引起的应激反应结果。

A.血清IL-24蛋白ELISA分析；B.假手术组和PHx组在0、3、6、12、24 h肝脏p-STAT3和GAPDH的蛋白质印迹法分析(n=5)。与0 h比较，aP<0.05。图4 部分肝切除后IL-24通路诱导肝脏应激反应

2.7p-STAT3和GAPDH 在细胞表面与受体结合后，IL-24激活多种细胞内信号通路，包括JAK-STAT通路。分别在0、3、6、12、24 h通过蛋白质印迹检测PHx组肝脏中的p-STAT3和GAPDH。结果表明，p-STAT3在前3小时内保持激活状态，p-STAT3升高在PHx后24 h(图4B)，这与血清IL-24水平一致。IL-24通过JAK-1与细胞表面受体信号结合，导致p-STAT3转录因子的激活。信号通路激活(JAK-1/STAT3)是由剖腹手术引起的应激反应。

3 讨 论

越来越多的研究集中在IL-24在人类疾病中的生理功能，因此IL-24被描述为IL-20家族细胞因子的成员，其中大部分集中在抗肿瘤特性上。值得注意的是，有研究发现IL-24是细胞增殖的新的关键介质[6，13]。

本研究表明，将mIL-24-Fc融合蛋白注射到小鼠皮肤中诱导角质形成细胞增殖。由于IL-22RA1在肝脏和上皮细胞中均高度表达，IL-24诱导小鼠角质形成细胞增殖，所以假设IL-24可以诱导肝细胞增殖。因此，在本研究中，确定了IL-24在肝脏再生中的作用。

IL-24通过2种异二聚体受体IL-20R1/IL-20R2和IL-22R1/IL-20R2起作用。在与受体结合后，IL-24诱导p-STAT3转录因子的快速激活，其参与细胞存活和增殖[6，13]。本研究结果显示，剖腹术后，PHx组血清IL-24水平持续升高，12 h达到峰值，然后开始下降。然而，肝细胞的IL-24 mRNA水平在12 h时显著升高，在48 h达到峰值，然后开始下降。血清和肝脏中IL-24的不同水平差异显著，因此检测到p-STAT3，其是IL-24的下游细胞因子。PHx后p-STAT3不断升高，在12 h达到峰值，然后开始降低。p-STAT3的不同趋势与血清IL-24水平一致。值得注意的是，假手术组和PHx组血清IL-24和p-STAT3的变化趋势是相同的。这些发现表明，血清IL-24和p-STAT3水平的不同是PHx后应激反应的结果。出乎意料的是，IL-24 mRNA的变化趋势与血清IL-24的变化趋势存在显著差异。这表明IL-24通过未知的细胞表面受体信号通路或非受体的方式促进肝脏再生。

本研究发现，血清中IL-24的上调是PHx后应激反应的结果。作者假设IL-24通过未知的细胞表面受体信号通路或非受体的方式刺激PHx后肝细胞增殖。然而，IL-24在肝脏再生中的作用尚不完全清楚。因此，IL-24在肝脏再生中的作用仍有待进一步研究。