HPLC法同时测定胡颓子叶中3种成分的含量*

杨 玲，付志丽，熊 燕，赵 坤，杨 滔，何 利

(1.贵州护理职业技术学院，贵州 贵阳 550025；2.贵州医科大学省部共建药用植物功效与利用国家重点实验室，贵州 贵阳 550014)

胡颓子叶(folium elaeagni)为胡颓子科胡颓子属植物胡颓子(ElaeagunsPungengsThunb)的干燥叶，完整叶呈椭圆形，两端钝或基部圆形，上表面黄绿色，下表面银白色，叶片常向背面反卷[1]。胡颓子叶性温，味酸涩，主产于陕西、云南、福建、贵州等地。胡颓子叶在我国应用历史悠久，具有敛肺、止咳平喘、活血、缓解支气管痉挛等功效[2-3]，主治肺虚、支气管哮喘、慢性气管炎、哮喘性支气管炎、风湿骨痛等症[4-6]。另外，胡颓子叶也是定喘灵、消炎止咳片、海珠喘息灵等多种中成药配方中的主要成分之一[7-8]。迄今为止，文献报道胡颓子属植物的主要化学成分包括黄酮类化合物、萜类和甾体、脂肪酸、生物碱、鞣质、木脂素、有机酸、糖苷等，其中对黄酮类化合物的研究较多，而对胡颓子叶中黄酮类化合物的研究以山柰酚、槲皮素、银锻苷、异鼠李素等为主[9-10]。药理研究表明，从胡颓子叶的乙醇提取物中分离得到的槲皮素、山柰素苷、葛花苷等化合物对人胃癌SGC-7901细胞和人宫颈癌Hela细胞的体外增殖有显著的抑制作用[11]。目前对于胡颓子叶中化学成分的含量测定鲜有报道，严重制约了其开发与利用，因此，对胡颓子叶的研究有待进一步深入。为了更好地利用胡颓子叶的药用价值，解决其用药安全、有效和可控性，亟需一种科学、合理的胡颓子叶的质量控制方法。本研究建立了高效液相色谱(HPLC)法同时测定胡颓子叶中槲皮素、银锻苷和山柰酚3种成分含量的测定方法，此方法简便、准确、重复性好，为胡颓子叶相关质量标准的制定奠定基础，同时为胡颓子资源的深度开发利用提供了一定的科学依据。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1仪器 Agilent 1260型HPLC仪(包括四元泵，在线脱气机，自动控温自动进样，柱温箱，DAD检测器，色谱工作站)，十万分之一天平(FA2004N型，上海菁海仪器有限公司)，KQ-3000型数控超声波清洁器(昆山市超声仪器有限公司，300 W)，SB-2000型水浴锅(上海爱朗仪器有限公司)。

1.1.2药材与试剂 胡颓子叶购买于药材市场和采自贵州不同地区。槲皮素对照品(生产批号：100081-201610)、山柰酚(生产批号：110861-201611)均购于中国食品药品检定研究院；银锻苷对照品(生产批号：20316-62-4)购自成都植标化纯生物技术有限公司；甲醇为色谱纯(Merck Millipore)，液相用水为超纯水。制样所用试剂甲醇、乙醇、磷酸、盐酸均为分析纯，水为蒸馏水。

2 方法与结果

2.1对照品溶液的制备 精密称取对照品槲皮素、银锻苷、山柰酚，置于容量瓶内，甲醇定容，得到浓度分别为52.2、105.1、104.8 μg/mL的槲皮素、银锻苷、山柰酚标准溶液。

2.2供试品溶液的制备 精密称取胡颓子叶样品粉末1.0 g，置于锥形瓶中，加入80.0 mL乙醇-15%盐酸(3.5∶1)，称定质量，加热回流提取4 h，冷却至室温，再次称定质量，用乙醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，经0.45 μm微孔滤膜过滤[12-13]，即得。

2.3色谱条件 色谱柱：Kromasil Eternity-5C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流速：1.0 mL/min；柱温：30 ℃；检测波长：360 nm；流动相：以甲醇作为A相，0.05%磷酸-水溶液作为B相，A-B(54∶46)等度洗脱，进样量5 μL，洗脱时间30 min[14]。HPLC图见图1。

A.对照品；B.供试品。1.槲皮素；2.银锻苷；3.山柰酚。图1 HPLC图

2.4方法学考察

2.4.1线性关系考察 精密量取“2.1”项下对照品储备液进行不同比例稀释，制得5个不同浓度对照品。精密吸取10 μL分别注入HPLC仪，测定峰面积，以对照品进样量(X，μg)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标，进行线性回归。结果表明各成分在各自进样量范围内线性关系良好，见表1。

表1 线性关系试验考察

2.4.2精密度试验 精密吸取槲皮素、银锻苷、山柰酚的混合对照品溶液，重复进样6次，结果槲皮素峰面积的相对标准偏差(RSD)为0.73%，银锻苷峰面积的RSD为0.61%，山柰酚峰面积的RSD为0.65%。

2.4.3稳定性试验 精密吸取供试品溶液，分别于0、4、8、12、16、24 h进样测定，结果槲皮素峰面积的RSD为0.69%，银锻苷峰面积的RSD为0.62%，山柰酚峰面积的RSD为0.63%。表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.4.4重复性试验 精密称取胡颓子叶样品6份各1.0 g，分别按“2.2”项下方法制备供试品溶液，进样测定。结果槲皮素的平均含量为336.0 μg/g，RSD为1.21%；银锻苷的平均含量为217.0 μg/g，RSD为1.18%；山柰酚的平均含量为704.0 μg/g，RSD为1.17%。

2.4.5回收率试验 取同一批次已知含量的胡颓子叶药材粉末9份，各0.5 g，精密称定，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，然后分别加入80%、100%、120% 3个水平的槲皮素(A)、银锻苷(B)和山奈酚(C)对照品溶液，各平行3份，在“2.3”项下色谱条件下测定，计算加样回收率，结果见表2。

2.5样品含量测定 精密称取不同产地的胡颓子叶样品粉末1.0 g，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.3”项下色谱条件下进样，记录各色谱峰面积，计算各样品中槲皮素、银锻苷、山柰酚的含量，结果见表3。

表3 含量测定结果(mg/g)

2.6试验条件的选择 试验以综合评分为考察指标，乙醇-15%盐酸比、提取时间(h)、提取温度(℃)、料液比等影响因素进行了单因素考察，其中综合评分=槲皮素含量×0.4+银锻苷含量×0.2+山柰酚含量×0.4。

2.6.1不同浓度的溶剂与15%盐酸比的选择 精密称取胡颓子叶样品粉末1.0 g，置具塞锥形瓶中，分别精密加入50 mL甲醇-15%盐酸(3∶1、3.5∶1、4∶1)、50 mL乙醇-15%盐酸(3∶1、3.5∶1、4∶1)，称定质量，在80 ℃条件下回流提取2 h，冷却，补重，滤过，用0.45 μm微孔滤膜过滤，并按“2.3”项下色谱条件对供试品进行测定。试验结果表明，乙醇-15%盐酸(3.5∶1)提取时综合评分最高，见图2，故选择乙醇-15%盐酸(3.5∶1)作为提取溶剂。

图2 不同溶剂与15%盐酸比对提取工艺的影响

2.6.2料液比的选择 精密称取胡颓子叶样品粉末1.0 g，置具塞锥形瓶中，分别精密加入20、40、60、80、100倍量的乙醇-15%盐酸(3.5∶1)，称定质量，在80 ℃条件下回流提取2 h，冷却，补重，滤过，用0.45 μm微孔滤膜过滤，并按“2.3”项下色谱条件对供试品进行测定。试验结果表明，料液比为1∶100时综合评分趋于稳定，见图3。故选料液比为1∶80的乙醇-15%盐酸(3.5∶1)。

图3 料液比对提取工艺的影响

2.6.3提取时间的考察 精密称取胡颓子叶样品粉末1.0 g，置具塞锥形瓶中，精密加入80 mL乙醇-15%盐酸(3.5∶1)，称定质量，在80 ℃条件下回流提取1、2、3、4 h，冷却，补重，滤过，用0.45 μm微孔滤膜过滤，并按“2.3”项下色谱条件对供试品进行测定。试验结果表明，提取时间为4 h时，综合评分下降，见图4。故3 h作为提取时间。

图4 提取时间对提取工艺的影响

2.6.4提取温度的考察 精密称取胡颓子叶样品粉末1.0 g，置具塞锥形瓶中，精密加入80 mL乙醇-15%盐酸(3.5∶1)，称定质量，在70、80、90 ℃条件下回流提取3 h，冷却，补重，过滤，用0.45 μm微孔滤膜过滤，并按“2.3”项下色谱条件对供试品进行测定。试验结果表明，提取温度到90 ℃时，综合评分不增加，见图5。故优选80 ℃作为提取温度。

图5 提取温度对提取工艺的影响

2.6.5正交试验设计 经单因素试验考察，对主要影响胡颓子叶药材提取的因素：乙醇-15%盐酸比(A)、提取时间(B)、提取温度(C)和料液比(D)进行考察，每个因素3个水平，进行L9 (34)正交试验，筛选最佳工艺条件，因素水平见表4，正交试验结果见表5。

表4 L9 (34)正交试验设计因素水平

表5 L9 (34)正交试验结果

2.6.6正交试验结果与分析 通过直观分析，影响因素的主次为乙醇-15%盐酸比>料液比>提取温度>提取时间，最佳提取条件为：A2B3C2D2，即乙醇-15%盐酸比3.5∶1，提取时间为4 h，提取温度为80 ℃，料液比为1∶80。验证分析结果，即对正交试验结果进行了方差分析见表6。结果表明，乙醇-15%盐酸比对提取工艺有显著性影响，与直观分析结果相符。

表6 方差分析结果

3 讨 论

黄酮类化合物具有保护消化系统、心血管、肝损伤，抗氧化、抗菌、抗病毒、抗肿瘤等药理作用[15-17]。胡颓子叶的化学成分槲皮素、银锻苷和山柰酚均属于黄酮类化合物，其中槲皮素具有较好的祛痰、止咳作用，并有一定的平喘、降血压、增强毛细血管抵抗力等作用[18]；银锻苷具有显著的降血糖、抗氧化等药理作用[19]；山柰酚具有防癌、抗癌、抗炎、抗氧化、抗菌、抗病毒等多种功效[20]。对胡颓子叶中的槲皮素、银锻苷及山柰酚进行含量测定可以更好地利用其药用价值。本试验建立了胡颓子中槲皮素、银锻苷、山柰酚含量测定的HPLC方法，以这3种成分的含量为综合指标，选取溶剂浓度、料液比、提取时间、提取温度进行正交试验，通过正交试验优化，确定最佳提取工艺为乙醇-15%盐酸比为3.5∶1，提取时间为4 h，提取温度为80 ℃，料液比为1∶80。在此条件下3种成分均具有较高的含量。本试验为完善胡颓子叶的质量控制方法提供了依据，为胡颓子药材的综合开发与利用奠定基础。