苦参饮片HPLC指纹图谱的建立及其中3种黄酮类成分的含量测定

韩惠超 叶世芸* 殷少文 刘巧 张艳琴

（1.贵州中医药大学 贵州 贵阳 550002；2.贵阳市第三人民医院；3.贵州得轩堂护康药业股份有限公司）

1 前言

苦参为豆科植物苦参（Sophora flavescens Ait.）的干燥根，具有清热燥湿、杀虫利尿的功效，主要用于治疗赤白带下、阴肿阴痒[1]。其特征明确的成分为苦参生物碱和苦参黄酮[2]，其中黄酮类化合物主要有抗炎、抗病毒等作用[3-5]。中药的有效成分是物质群，而非单一的化学成分[6]。目前，关于苦参黄酮质量控制的研究较少，覆盖全国七大产区的苦参黄酮类成分指纹图谱研究仅有一篇[1]，且采用的是多个波长检测的方法[7-10]。基于此，本文收集全国14个产地共30批次苦参药材为检测样品，覆盖了东北、华北、华东、华中、华南、西南、西北7个产区，采用单一波长方法，通过指纹图谱和含量测定，对苦参黄酮类成分含量的地区差异进行研究，以期为苦参的质量评价提供科学依据。

2 材料

2.1 仪器

高效液相色谱仪（LC-20AT型，日本岛津公司）；色谱柱（Ultimate® XB-C18，规格：250×4.6mm，5 μm，月旭科技股份有限公司）。

2.2 药品与试剂

三叶豆紫檀苷对照品（批号161108，纯度≥98%）；苦参醇F对照品（批号170901，纯度≥98%）；苦参酮对照品（批号161011，纯度≥98%）（北京世纪奥科生物技术有限公司）。甲醇、乙醇、乙腈均为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为纯净水。

经贵州中医药大学魏升华教授鉴定，本文采集的30批不同产地的苦参饮片，均为豆科植物苦参（Sophora flavescens Ait.）的干燥根，来源信息见表1。

表1 苦参饮片的来源

3 方法与结果

3.1 建立指纹图谱

3.1.1 混合对照品溶液的制备

精密称取适量的三叶豆紫檀苷、苦参酮、苦参醇F对照品；加入甲醇，配制成每1 mL含三叶豆紫檀苷0.725 mg、苦参酮1 mg、苦参醇F 0.830 mg的对照品溶液，摇匀。

3.1.2 供试品溶液的制备

称取苦参粉末0.5 g（过3号筛），置于50 ml锥形瓶中；加入75%的乙醇25 mL，称定；超声提取1 h，补足重量，摇匀，静置；经0.45μm微孔滤膜过滤，即得。

3.1.3 色谱条件

采用Ultimate® XB-C18（250×4.6mm，5 μm）色谱柱，乙腈（A）—水（B）为流动相梯度洗脱，程序：0～25 min，40%～50%A；25～30 min，50%～70%A；30～38min，70%A）；检测波长：295 nm；进样量：20 μL；柱温：35℃；流速：1 mL/min。

3.1.4 精密度试验

取S1号供试品溶液，连续进样6次。结果显示，以苦参酮为参照峰，各共有峰的相对保留时间和相对峰面积RSD均＜3%，表明仪器具有良好的精密度。

3.1.5 稳定性试验

取S1号供试品溶液，在0、2、4、8、16、24 h进行检测。结果显示，以苦参酮作为参照峰，各共有峰的相对保留时间和相对峰面积RSD均＜3%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

3.1.6 重复性试验

取S1号供试品溶液6份，分别进样检测。结果显示，以苦参酮作为参照峰，各共有峰的相对保留时间RSD和相对峰面积RSD均＜3%，表明该方法的重复性良好。

3.1.7 指纹图谱的生成

按“3.1.2”项的方法制备30批样品的供试品溶液，按“3.1.3”项的色谱条件进样测定，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2012 A版）进行分析，详见图1。

图1 31批苦参饮片指纹图谱

3.1.8 相似度评价

采用上述评价系统软件，计算30批样品之间的相似度。结果显示，30批样品相似度范围在0.914～1.000之间，均＞0.9。

3.2 含量测定

3.2.1 线性关系考察

精密吸取“3.1”项配置的不同浓度的标准品溶液，进针测定，测得三叶豆紫檀苷、苦参酮、苦参醇F的线性方程分别为Y=107X+4229.4（R2=0.999 6）、Y=2×107X-26 918（R2=1）、Y=4×107X-309 64（R2=0.999 9），分 别 在0.002 84～0.181 20、0.005 87～0.375 00、0.003 25～0.207 50范围内线性关系良好。

3.2.2 精密度试验

取混合对照品溶液，按“3.1”项的色谱条件重复进针6次，测得三叶豆紫檀苷、苦参酮、苦参醇F、峰面积值RSD分别为0.82%、0.79%、1.12%，均＜3.0%，表明该仪器的精密度良好。

3.2.3 稳定性试验

称取苦参粉末0.5 g（编号：S1），精密称定，按“3.1”项提取供试品溶液，分别于0、2、4、8、12、16 h时，进样测定。测得三叶豆紫檀苷、苦参酮、苦参醇F的峰面积值RSD分别为0.57%、1.79%、2.17%（n=6），均＜3.0%，表明样品在16 h内稳定性良好。

3.2.4 重复性试验

称取该药材粉末6份，每份约0.5 g，精密称定，按“3.1”项提取供试品溶液，进行测定。测得三叶豆紫檀苷、苦参酮、苦参醇F峰面积值RSD分别为0.82%、0.79%、1.13%，均＜3.0%，表明该方法的重现性良好。

3.2.5 加样回收率试验

取已知浓度的苦参粉末9份，每份约0.25 g，精密称定后按高、中、低剂量加入标准品，按“3.1”项提取供试品进行测定，记录峰面积并计算加样回收率，结果见表2。

表2 加样回收率试验

（续表2）

3.2.6 30批样品含量测定

取30批苦参药材，按“3.1”项的方法制备供试品溶液，测定各批苦参药材中三叶豆紫檀苷、苦参酮、苦参醇F的含量，结果见表3。

表3 样品含量测定结果（mg/g）

3.3 聚类分析

将30批苦参样品中3种黄酮类成分的含量测定结果导入SPSS 21.0软件，选用组内连接聚类法进行分析，结果见图3。以d=10划分，30批样品共聚为3类：样品S6、S16聚为第Ⅰ类，各个成分的含量均相对较高，分别来自广西和黑龙江；样品S8、S17聚为第Ⅱ类，各个成分的含量均相对较低，分别来自贵州和湖南；其余26批样品聚为第Ⅲ类，均来自内蒙、云南、四川等地，样品中总含量在9.33～16.63 mg/g之间。

图2 31批苦参样品聚类分析图

4 讨论

本文在前期研究中，考察了回流提取法、超声提取法这2种提取方法，比较了不同提取溶剂（甲醇、乙醇），结果表明无显著差异，考虑到方法的经济性，故选择乙醇回流提取的方法。在单因素试验的基础上，以乙醇浓度、回流时间、料液比为影响因素，三叶豆紫檀苷，苦参醇F，苦参酮含量为评价指标，采用Box-Behnken响应面法优化苦参提取条件。

指纹图谱相似度结果显示，30批苦参样品的相似度良好，表明苦参药材化学成分大部分产地的一致性较好；不同产地30批苦参药材中3种黄酮类成分含量测定的直观分析结果显示，质量最高的苦参产于广西，质量最低的苦参产于湖南。

聚类分析结果显示，广西、黑龙江产样品中3种成分的总含量较高，贵州、湖南产样品中3种成分的总含量较低，其余26批样品均聚为一大类，以内蒙、四川、云南等地为主要类别，产区之间的差异亦不明显。马鸿雁等[8]研究发现，甘肃样品的质量分数最低，而本文研究发现，贵州、湖南等5个省份样品的含量均低于甘肃，推测出现这种情况的原因可能与苦参的生长环境有关，有待后续研究的进一步探讨。

综上所述，本文所建指纹图谱和3种黄酮类化合物成分的含量测定方法可行，能够为苦参药材的质量控制提供参考，值得推广。