Notch3信号通路对三阴性乳腺癌细胞株BT20活性的影响及分子机制

金海丽 陈嬉 罗华荣 徐铖 孙亚萌 林天真 甘梅富

目前研究发现，Notch 信号通路在胰腺癌、非小细胞肺癌、卵巢癌等多种恶性肿瘤中被激活，与癌细胞的增殖、分化、迁移、侵袭、抗凋亡有关，促进肿瘤的发展[1～3]。Notch信号通路由Notch受体、配体等组成，目前已知包括Notch1～4 在内的4 个Notch 同源体[4]；相关研究显示，Notch1、Notch3 高表达与恶性肿瘤患者预后明显相关[5，6]。目前关于Notch3 对三阴性乳腺癌作用的研究仍较为少见，为此本次研究在体外培养三阴性乳腺癌细胞株BT20，探讨Notch3调节BT20细胞增殖的机制，旨在为三阴性乳腺癌的分子靶向治疗提供新方向。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 乳腺癌细胞株BT20 由上海研域生物科技有限公司生产；胎牛血清、DMEM培养基由上海广锐生物科技有限公司生产；脂质体2 000 转染试剂由北京蓝博斯特生物技术有限公司生产；Trizol 试剂、RIPA 裂解液由上海素尔生物科技有限公司生产；鼠抗人NF-κB 单克隆抗体，鼠抗人GAPDH 多克隆抗体，HRP 标记的山羊抗鼠由北京华达杰瑞生物技术有限公司生产。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养、转染与分组 本次实验时间为2021 年1 月，将BT20 细胞置于含10%胎牛血清的DMEM 培养基中，37 ℃、5%CO2细胞培养箱中常规培养，收集对数期细胞，胰蛋白酶消化并计数，按1×105个/孔接种于6 孔板中，继续培养24 h，观察细胞融合度超过50%时使用脂质体2 000 进行转染。本实验分为空白对照组、阴性对照组、Notch3 siRNA组。为防止脂质体2 000 对BT20 细胞的毒性作用，转染6 h 后更换为DMEM 完全培养基。小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）由上海基屹生物科技有限公司公司设计合成，Notch3 siRNA 组正义序列：5′-TTAACGUCAACA AAGGACCUG-3′，反义序列：5′-TTCAGGUCCUUUGU UGACGUU-3′；阴性对照组正义序列：上游5′-TTUGCACUGUGCAAGCCUCUU -3′，反义序列：5′ -TTAAGA GGGCUUGCACAGUCA-3′；空白对照组常规培养不做任何处理。

1.2.2 细胞增殖 采用四唑盐比色法（methylthiazolyl method，MTT）法检测BT20 细胞增殖情况，取各组对数生长期细胞，按1×104个/孔的密度接种于96 孔板中，观察细胞融合度超过50%时进行转染。分别于转染后1 d、2 d、3 d、4 d、5 d 检测细胞增殖情况。加入MTT 20 µl/孔，继续培养4 h，弃去孔内细胞培养液，加入二甲基亚砜150 µl/孔，匀速振荡10 min，上酶标仪读取490 nm 处吸光度值，每组各5 个复孔。

1.2.3 Transwell细胞迁移和侵袭实验 将饥饿处理后的各组细胞消化、重悬计数后，向上室加入500 µl无血清的DMEM培养基，调整细胞浓度为4×105个/ml，下室中加入500 µl 含10%胎牛血清的DMEM 培养基，37 ℃、5%CO2细胞培养箱中培养24 h，4%多聚甲醛固定30 min，洗涤后使用0.1%结晶紫染色，光学显微镜下采集图像，随机选取5 个视野下观察迁移细胞数。经基底胶与不含胎牛血清的DMEM 培养基混合后，向上室加入100 µl，调整细胞浓度为4×105个/ml，其余步骤同迁移实验，观察侵袭细胞数。

1.2.4 RT-PCR 检测 Trizol 法提取细胞总RNA，逆转录得到cDNA。Notch3、CyclinD1、BCL-2、BCL-xl、GAPDH 引物由上海索宝生物科技有限公司设计合成，引物序列见表1。反应条件：95 ℃1 min，95 ℃30 s，72 ℃30 s，共40 个循环，延伸72 ℃5 min。扩增产物行2% 琼脂糖凝胶电泳，计算Notch3、CyclinD1、BCL-2、BCL-xl mRNA 的相对表达量。

表1 Notch3、CyclinD1、BCL-2、BCL-xl、GAPDH引物序列

1.2.5 Western blot 检测 RIPA 裂解液提取细胞总蛋白，BCA 蛋白定量，取40 µg 蛋白行10% 聚丙烯酰胺凝胶电泳，湿法转至聚偏氟乙烯膜，室温下5%脱脂奶粉封闭1 h，加入鼠抗人NF-κB 单克隆抗体（1：200 稀释），鼠抗人GAPDH 多克隆抗体（1∶1000稀释），4 ℃孵育过夜，洗膜后滴加HRP 标记的山羊抗鼠IgG（1∶2000 稀释），室温静置2 h，ECL 显色，凝胶成像系统拍照，以GAPDH 为内参对照计算各条带灰度值。

1.3 统计学方法 采用SPSS 19.0 统计学软件。计量资料以均数±标准差（）表示，比较采用方差分析和LSD-t检验。设P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Notch3 siRNA 转染效果 Notch3 siRNA 转染48 h后，Notch3 siRNA 组BT20细胞中Notch3 mRNA相对表达量为0.24±0.08，明显低于阴性对照组的表达量（1.37±0.24），两组比较，差异有统计学意义（t=18.37，P＜0.05）。

2.2 三组细胞增殖水平比较见表2

表2 三组细胞培养不同时间点增殖水平比较

由表2 可见，培养第1 天时，三组细胞增殖水平比较，差异无统计学意义（F=0.31，P＞0.05）；培养第2 天、第3 天、第4 天、第5 天时，三组细胞增殖水平比较，差异均有统计学意义（F分别=6.87、11.04、15.98、26.39，P均＜0.05）。培养第2 天、第3 天、第4 天、第5 天时，Notch3 siRNA 组细胞增殖水平明显低于空白对照组与阴性对照组，差异均有统计学意义（t分别=3.15、4.03、2.94、3.26、4.01、3.50、2.97、3.11，P均＜0.05）；空白对照组与阴性对照组细胞增殖水平比较，差异均无统计学意义（t分别=0.18、0.37、0.41、0.62，P均＞0.05）。组内比较，随着培养时间的延伸，三组细胞增殖水平均逐渐增加，差异均有统计学意义（F分别=5.94、7.65、9.76，P均＜0.05）。

2.3 三组细胞迁移和侵袭能力比较见表3

表3 三组细胞迁移和侵袭能力比较/个

由表3 可见，三组迁移细胞数、侵袭细胞数比较，差异均有统计学意义（F分别=12.79、14.07，P均＜0.05）。两两比较，Notch3 siRNA 组迁移细胞数、侵袭细胞数均明显低于空白对照组和阴性对照组，差异均有统计学意义（t分别=5.32、6.02、4.97、5.07，P均＜0.05）；空白对照组与阴性对照组迁移细胞数、侵袭细胞数比较，差异均无统计学意义（t分别=0.39、0.57，P均＞0.05）。

2.4 三组细胞核内NF-κB 蛋白表达水平比较Notch3 siRNA 组细胞核内NF-κB 蛋白相对表达量为1.83±0.27，明显低于空白对照组（4.71±0.63）和阴性对照组（4.65±0.58），差异均有统计学意义（t分别=19.69、18.07，P均＜0.05）；空白对照组与阴性对照组NF-κB 蛋白相对表达量比较，差异无统计学意义（t=0.29，P＞0.05）。

2.5 Notch3对下游基因表达的影响见表4

表4 三组CyclinD1、BCL-2、BCL-xl mRNA相对表达量比较

由表4 可见，三组下游基因CyclinD1、BCL-2、BCL-xl mRNA 的相对表达量比较，差异均有统计学意义（F分别=11.26、16.94、18.17，P均＜0.05）。两两比较，Notch3 siRNA 组下游基因CyclinD1、BCL-2、BCL-xl mRNA 的相对表达量均明显低于空白对照组和阴性对照组，差异均有统计学意义（t分别=4.15、3.02、3.12、2.98、3.56、3.16，P均＜0.05）；空白对照组下游基因CyclinD1、BCL-2、BCL-xl mRNA 相对表达量与阴性对照组比较，差异均无统计学意义（t分别=0.13、0.19、0.33，P均＞0.05）。

3 讨论

乳腺癌是女性中最常见的恶性肿瘤之一，发病率占全部恶性肿瘤的8%～12%[7]。我国虽然是乳腺癌发病率较低的国家，但近年来其发病率呈快速增加，有年轻化趋势[8]。乳腺癌是一类特异质明显的恶性肿瘤，在免疫表型、形态、治疗反应等方面均存在较大差异[9]。三阴性乳腺癌组织分化程度多较差，复发、远处转移的风险较高[10]；由于雌激素受体、孕激素、原癌基因人类表皮生长因子受体2 均为阴性，不适用于内分泌药物、注射用曲妥珠单抗等治疗[11]，化疗仍是三阴性乳腺癌的主要辅助治疗手段，但患者对化疗药物的敏感性存在较大的个体差异[12]，分子靶向治疗是改善三阴性乳腺癌患者预后的研究新方向，但目前相关研究报道较为少见。

本次研究使用脂质体2 000 向BT20 细胞内转染Notch3 siRNA 后，Notch3 mRNA 表达水平明显降低，且培养第2～5 天时，Notch3 siRNA 组细胞增殖水平明显低于空白对照组与阴性对照组（P均＜0.05），提示siRNA 介导的Notch3 能够明显下调BT20细胞中Notch3表达水平，进一步抑制细胞的增殖。癌细胞的迁移和侵袭是患者不良预后的主要原因[13]。相关研究显示，Notch3 在卵巢上皮性癌变、大肠癌、胰腺癌、非小细胞肺癌等多种肿瘤组织中均存在高表达，调控肿瘤的发生、发展，与癌细胞增殖、分化、迁移、侵袭等过程明显相关[14]；但关于Notch3对三阴性乳腺癌的影响仍鲜有研究报道。本次研究显示，Notch3 siRNA组迁移细胞数、侵袭细胞数均明显低于空白对照组和阴性对照组（P均＜0.05），提示下调Notch3 表达可有效降低BT20 细胞的迁移和侵袭能力。

Notch3 信号通路与NF-κB 均能够介导细胞的增殖、迁移、侵袭等过程[15]。有研究显示，在转染Notch3反义寡核苷酸的大鼠体内，NF-κB表达水平明显下降；重新导入活化的Notch3基因片段后，NF-κB表达水平也逐渐恢复正常[16]。本次研究结果显示，Notch3 siRNA 组细胞核内NF-κB 蛋白相对表达量明显低于空白对照组、阴性对照组（P均＜0.05）；提示Notch3 表达下调可有效降低BT20 细胞的NF-κB的转录活性，NF-κB 可能作为Notch3 的下游靶基因参与Notch3 介导的生物学功能。同时，NF-κB 活化后在细胞核中与相应的靶基因特异性结合，发挥转录因子活性，调节CyclinD1、BCL-2、BCL-xl 等下游靶基因的转录。其中CyclinD1 为细胞周期调节蛋白，与雌激素受体阴性的乳腺癌患者预后有关[17]；BCL-2、BCL-xl 属于BCL 家族成员，BCL-2 具有促进细胞增殖、分化，抑制凋亡的活性，BCL-xl 在癌细胞化疗耐药性发生、发展中具有重要作用[18]。本次研究显示，Notch3 siRNA组下游基因CyclinD1、BCL-2、BCL-xl mRNA表达水平明显低于空白对照组和阴性对照组（P均＜0.05），提示Notch3 表达下调可能通过降低CyclinD1、BCL-2、BCL-xl 表达来抑制BT20细胞的增殖、迁移和侵袭。

综上所述，Notch3 siRNA 下调Notch3 表达能够有效抑制BT20 细胞增殖、迁移和侵袭，其机制可能与Notch3 表达下调降低了NF-κB 蛋白及CyclinD1、BCL-2、BCL-xl基因表达有关。