蜂毒肽通过线粒体凋亡途径促进皮肤鳞状细胞癌A431细胞株对5-FU的敏感性

宋晗， 田庆均

(1.武汉市红十字会医院皮肤科，湖北省武汉市 430015；2.武汉市第一医院皮肤科，湖北省武汉市 430022)

皮肤鳞状细胞癌(cutaneous squamous cell carcinoma，CSCC)是发生于表皮或者附属器细胞的恶性肿瘤，发病率呈逐年上升趋势[1]。CSCC治疗以手术切除为主，但部分患者在切除后仍出现复发和转移。单一药物治疗CSCC易产生耐药性，效果不佳，而同时针对多个肿瘤靶点的联合用药治疗有助于逆转耐药性。5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)能穿透细胞膜干扰DNA修复和蛋白质合成，从而抑制细胞增殖，单独或联合用于化疗效果显著，但会产生耐药性[2-3]。蜂毒肽是蜂毒的主要活性物质，具有抗菌、抗炎、抗病毒等效果[4]。研究表明，蜂毒肽可以激活细胞线粒体凋亡途径，促进细胞凋亡[5]。本文探讨蜂毒肽通过线粒体凋亡途径促进CSCC A431细胞株对5-FU敏感的机制，报道如下。

1 材料和方法

1.1 动物和细胞

人皮肤鳞状细胞癌A431细胞株与人正常皮肤HaCaT细胞株购于武汉普诺赛生命科技有限公司；40只健康SPF级雄性BALB/c裸鼠购于武汉贝赛模式生物科技有限公司，体质量(20.00±2.00)g，使用许可证号SYXK(鄂)2022-0124，生产许可证号SCXK(鄂)2022-0029。所有小鼠正常饮食饮水，适应性饲养1周后进行实验。

1.2 主要试剂与仪器

DMEM培养液、胰蛋白酶、胎牛血清购于美国Gibco公司；BCA蛋白定量试剂盒、CCK8试剂盒、Annexin V/FITC细胞凋亡试剂盒购于上海碧云天生物科技有限公司；RIPA裂解液购于上海翌圣生物科技有限公司；线粒体凋亡蛋白(Smac)、活化半胱氨酸蛋白酶-3(cleaved Caspase-3)、细胞色素C(Cyt C)、促凋亡蛋白(Bax)兔抗人一抗，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗购于美国Abcam公司。

SpectraMax iD3 多功能酶标仪购于上海美谷分子仪器有限公司；Cytek NL-CLC 全光谱流式细胞仪购于上海聚慕医疗器械有限公司；DYCZ-24DH型双板垂直电泳仪、WD-9413D型一体式凝胶成像系统购于北京六一仪器厂。

1.3 细胞培养与蜂毒肽浓度的筛选

取对数生长期的A431细胞，胰蛋白酶消化后收集并离心后用无血清DMEM培养液重悬，在96孔板中加入100 μL细胞悬液(2×103个/孔)，培养12 h后分别加入蜂毒肽，细胞培养液终浓度为0、0.125、0.25、0.5、1、2 μmol/L(设置3个复孔)，继续培养72 h，取出后加入10 μL 5 g/L CCK-8溶液。设置调零孔、空白孔。孵育1 h，采用酶标仪测定各孔在450 nm的光密度值(optical density，OD)。细胞存活率(%)=(待测孔OD值-调零孔OD值)/(空白孔OD值-调零孔OD值)×100%[6]，根据细胞存活率计算半数抑制浓度(IC50)。

1.4 CCK8检测细胞毒性及细胞存活率

分别收集HaCaT、A431细胞，在96孔板中加入100 μL(2×103个/孔)细胞悬液，并分别分为对照组、蜂毒肽组、5-FU组、联合组，于CO2培养箱中培养。12 h后对照组不作干预；蜂毒肽组用筛选的IC50浓度的蜂毒肽(0.5 μmol/L)作为终浓度培养；5-FU组用终浓度为0.25 μmol/L 5-FU溶液培养；联合组用0.5 μmol/L蜂毒肽溶液和0.25 μmol/L 5-FU溶液共同培养，设置3个复孔，继续培养24、48、72 h。取出加入10 μL 5 g/L CCK-8溶液。孵育1 h，酶标仪测定各孔在450 nm OD值。细胞存活率计算公式同方法1.3。

1.5 流式细胞仪检测细胞凋亡率与细胞周期

各组A431细胞培养72 h后，收集细胞，加100 μL 1×Binding Buffer重悬。加5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI Staining Solution混匀。室温下避光反应15 min。加400 μL 1×Binding Buffer，混匀，流式细胞仪检测各组细胞凋亡率。

取上述离心后细胞用DMEM培养基重悬，以2×104个/mL接种于6孔板中，培养24 h。弃去上清液，PBS洗2次，加70%乙醇固定细胞(4 ℃过夜)，向各孔中加300 μL 50 mg/L PI+10 μL 100 mg/L RNase，4 ℃中避光孵育30 min，流式细胞仪检测各组细胞的细胞周期。

1.6 Western blotting法检测Smac、cleaved Caspase-3、Cyt C、Bax蛋白表达水平

取1.5中各组细胞，收集后加200 μL RIPA裂解液，充分裂解后12 000 r/min离心，采用BCA试剂盒测定蛋白浓度。进行SDS-PAGE凝胶电泳，结束后依次进行转膜、封闭(5%脱脂奶粉)、一抗孵育(1∶1 000稀释)、二抗孵育(1∶500稀释)，洗膜，用ECL化学发光剂显色。在凝胶成像仪中观察目的蛋白条带，以β-actin作为内参蛋白，计算各蛋白的相对灰度值。

1.7 体外荷瘤检测肿瘤生长抑制率

将40只BALB/c裸鼠随机分为4组(对照组、蜂毒肽组、5-FU组、联合组)，每组10只。取1.6中各组处于对数生长期的各组A431细胞在同一组名的裸鼠背部进行皮下接种，每只裸鼠的接种量为0.3 mL(1×108个/mL)。在接种后的第3天开始测量肿瘤体积，此后每3天测量一次，接种后的第30天测量肿瘤体积后将各组裸鼠处死，饲养期间对照组有3只裸鼠死亡，蜂毒肽组有1只裸鼠死亡，剔除死亡裸鼠数据后，其他数据均纳入统计分析。根据第30天肿瘤体积计算抑瘤率：肿瘤体积(V)=长×宽2/2；抑瘤率(%)=(1-V待测/V对照)×100%。

1.8 统计分析

数据均采用SPSS 25.0版软件进行分析处理，多样本计量资料比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 蜂毒肽浓度筛选

随着蜂毒肽浓度的增加，A431细胞存活率逐渐下降，IC50为0.51 μmol/L(图1)。

图1 不同浓度蜂毒肽对A431细胞存活率的影响

2.2 蜂毒肽对各组HaCa T细胞毒性的影响

与对照组和蜂毒肽组比较，72 h时5-FU组和联合组的HaCaT细胞存活率降低(P<0.05;表1)。

表1 不同时间各组HaCaT细胞存活率的比较 单位：%

2.3 蜂毒肽对各组A431细胞存活率的影响

与对照组比较，不同时间点蜂毒肽组、5-FU组、联合组的A431细胞存活率均降低(P<0.05)；与蜂毒肽组和5-FU组比较，不同时间点下联合组的A431细胞存活率均降低(P<0.05;表2)。

表2 不同时间各组A431细胞存活率的比较 单位：%

2.3 各组细胞凋亡率和细胞周期的比较

与对照组比较，蜂毒肽组、5-FU组、联合组A431细胞凋亡率增加(P<0.05)；与蜂毒肽组和5-FU组，联合组细胞凋亡率增加(P<0.05；图2)。与对照组比较，蜂毒肽组、5-FU组、联合组G0/G1期细胞比例增加(P<0.05)；与蜂毒肽组和5-FU组比较，联合组G0/G1期细胞比例增加(P<0.05)。与对照组比较，蜂毒肽组、5-FU组、联合组S期与G2/M期细胞比例降低(P<0.05)；与蜂毒肽组和5-FU组比较，联合组S期与G2/M期细胞比例降低(P<0.05；图3)。

图2 流式细胞仪检测各组A431细胞培养72 h时的凋亡情况a为P<0.05，与对照组比较；b为P<0.05，与5-FU组比较，c为P<0.05，与蜂毒肽组比较。

图3 流式细胞仪检测各组细胞培养72 h时的细胞周期a为P<0.05，与对照组比较；b为P<0.05，与5-FU组比较，c为P<0.05，与蜂毒肽组比较。

2.4 各组细胞Smac、cleaved Caspase-3、Cyt C、Bax蛋白表达水平的比较

与对照组比较，蜂毒肽组、联合组的细胞的Smac、cleaved Caspase-3、Cyt C、Bax蛋白表达均增加(P<0.05)；与5-FU组和蜂毒肽组比较，联合组细胞的Smac、cleaved Caspase-3、Cyt C、Bax蛋白表达均增加(P<0.05；图4)。

图4 各组细胞培养72 h时细胞中Smac，cleaved Caspase-3，Cyt C，Bax蛋白表达水平a为P<0.05，与对照组比较；b为P<0.05，与5-FU组比较，c为P<0.05，与蜂毒肽组比较。

2.5 各组肿瘤生长抑制率的比较

肿瘤生长第15～30天，与对照组、蜂毒肽组和5-FU组比较，联合组的肿瘤体积缩小(P<0.05)。第30天蜂毒肽组、5-FU组、联合组的肿瘤生长抑制率差异有显著性(P<0.05；图5)。

3 讨 论

5-FU是一种抗嘧啶代谢药物，其代谢产物可阻断尿嘧啶脱氧核苷转化为胸腺嘧啶脱氧核苷，阻止DNA和RNA的合成[7]。但长期使用5-FU会使肿瘤细胞的敏感性降低，产生耐药性[8]。线粒体参与了细胞凋亡的过程，当细胞受到DNA损伤等外界刺激时，会激活细胞内线粒体凋亡途径，促使细胞发生程序性凋亡[9]。

本研究中，蜂毒肽组、5-FU组、联合组的A431细胞存活率降低，且联合组降低更明显，说明蜂毒肽可增强人皮肤鳞状细胞癌A431细胞对5-FU的敏感性。蜂毒肽是一种蜂毒中分离出的功能性物质，约占蜂毒干重的50%，研究显示，蜂毒肽可抑制人口腔鳞状细胞癌的增殖存活率，抑制细胞迁移[10]。本研究中与蜂毒肽组和5-FU组比较，联合组G0/G1期细胞比例增加，S期与G2/M期细胞比例降低，且联合组细胞凋亡率更高，说明联合使用蜂毒肽和5-FU可以将细胞阻滞在G0/G1期，促进细胞凋亡。此外，本研究中，联合组肿瘤生长第30天的肿瘤生长抑制率较蜂毒肽组和5-FU组升高，说明蜂毒肽可协同增强5-FU抗肿瘤效果。研究显示[11]，蜂毒肽可抑制非小细胞肝癌A549细胞的增殖，促进其凋亡。由此，蜂毒肽与5-FU联合应用可促进癌细胞对5-FU的敏感性，联合使用比单一使用效果更好。本研究中，蜂毒肽组、5-FU组、联合组Smac、cleaved Caspase-3、Cyt C、Bax表达增加，且联合组增加更显著。Bax是促细胞凋亡蛋白，正常情况下会在线粒体膜外抑制Cyt C与Smac的释放。但在外界刺激的作用下Bax会转移到线粒体膜上，破坏线粒体膜的完整性，导致Cyt C与Smac从线粒体中释放，诱发细胞凋亡[12]。蜂毒肽可以通过激活线粒体凋亡途径，诱导胃癌细胞SGC-7901细胞的凋亡，Smac与Cyt C蛋白的表达显著上升[13]。

综上，蜂毒肽可增强人皮肤鳞状细胞癌A431细胞对5-FU的敏感性，蜂毒肽和5-FU联合使用可以将A431细胞有效阻滞在G0/G1期，促进细胞凋亡，抑制细胞增殖，这一作用可能是通过激活线粒体凋亡途径实现的。