一种高效的藻类叶绿素定量提取方法

夏明升

（安徽省通源环境节能股份有限公司，安徽 合肥 230001）

叶绿素是所有光合浮游植物必需的光合色素，通常用作估算生物量的指标，也是光合研究的基本参数。利用有机溶剂从细胞中提取叶绿素并采用分光光度法进行测定是叶绿素定量分析的常用方法。藻类细胞中的大多数叶绿素分子与蛋白质或脂质结合，外层有细胞膜、细胞壁及其他结构屏障。如何高效地将叶绿素从细胞中萃取出来是准确测定藻类叶绿素含量的关键。叶绿素的提取方法种类繁多，其中最大的区别是使用的有机溶剂不同[1]。多数研究使用丙酮（90%）[2-6]和乙醇（90%）[7-9]，甲醇、二甲亚砜等的应用也有少量的研究报道[10-12]。然而，从不同溶剂提取出的叶绿素产量通常因藻类（或植物材料）而异，有时会出现提取不完全的情况。按照公开的方法经多次提取后，藻颗粒仍然呈深绿色的情况并不少见。

有较多研究对叶绿素提取方法进行了改进。研究表明，相比一般有机溶剂，N，N-二甲基甲酰胺（DMF）对叶绿素提取效果更好[13-15]，特别对一些具有提取抗性的绿藻[14，16]。采用DMF，不必破坏藻细胞，只需浸泡一会，即可完成大部分藻类的叶绿素提取。然而，当我们尝试从一些绿藻中提取叶绿素时，参考国外已发表的方法[13，17]，在5℃或室温下，经过多次重复浸泡提取，最终藻细胞团仍然呈深绿色，表明针对具有提取抗性的藻类，在常温条件下采用DMF浸泡提取叶绿素仍然存在一些不足。

升高有机溶剂的温度可以提高叶绿素提取效率[18-19]，国际标准ISO 10260-1992[8]的叶绿素测量方法推荐热乙醇（75℃）浸泡5 min，其他一些报告也显示热丙酮、甲醇和二甲基亚砜（DMSO）比冷溶剂更有效[20-23]。然而，这些公开的研究方法似乎对我们实验室实验中的一些顽固的藻类来说提取效果不佳。由于较高的温度可以提高从细胞中提取的叶绿素含量[24-25]，并且叶绿素可以在低于沸点的温度下在热有机溶剂中稳定20 min[18]，沸点高达153℃的DMF 应该是比其他低沸点溶剂更好的选择。目前还没有关于热DMF法提取叶绿素的研究报道。

本研究用实验室培养的绿藻蛋白核小球藻（chlorella phyrenoidosa）进行热DMF提取的最佳温度和浸泡时间的研究；对乙醇、丙酮和DMF提取方法进行了比较分析。结果表明，改进的热DMF法是一种更有效的叶绿素提取方法。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

乙醇、丙酮、DMF，分析纯；白核小球藻（chlorella phyrenoidosa），采用BG11 培养基，在温度为28℃、光照强度为3 000 Lx的条件下培养。

UV-2100 紫外/可见光分光光度计，Unico；Centri⁃fuge 5910 R离心机，Eppendorf；HWS-28恒温水浴锅，上海精密。

1.2 研究方法

1.2.1 叶绿素的提取

藻类液体培养物以8 000 g 离心10 min，细胞沉淀转移至15 mL 离心管中进行叶绿素提取。操作方法和步骤参考国际标准ISO 10260-1992[8]以及Suzu⁃ki[20]的报道。将水浴锅加热至预定温度后，分别测试90%丙酮、90%乙醇和纯 DMF 对藻类样品的叶绿素提取效果。热提取完成后，立即将装有叶绿素溶液的容器转移到冷水浴中冷却至室温。本研究中使用的热提取方案汇总在表1中。提取完成后，将溶液以10 000 g离心5 min，上清液用于叶绿素定量分析。

1.2.2 测定与计算

通过分光光度计对提取物中的叶绿素进行定量。以下三个方程分别用于计算丙酮、乙醇和DMF 中的叶绿素浓度 Ca，Ce和 Cd（mg·L-1）[8，22，26]。

其中E664，E665和E750为新鲜叶绿素溶液在664 nm，665 nm和750 nm处的吸光度，A664和A665为酸化溶液（在1 min内将50 μL 1.0 mol·L-1HCl加入5 mL提取物中）在664 nm，665 nm和750 nm处的吸光度。Va、Ve和Vd分别代表丙酮、乙醇和DMF的提取液体积；Vs是藻液样品的体积。

1.2.3 数据分析

评估不同提取方法的精度，采用标准偏差（SD）和变异系数（Cv），计算公式为Cv=（SD/mean）× 100%。

用方差分析（One-way ANOVA）统计不同提取方法的叶绿素浓度差异。采用Duncan法对各组结果进行检验比较，差异显著阈值为p< 0.05。

2 实验结果

2.1 热提取法的最佳温度

在不同温度下用DMF 提取的叶绿素浓度如图1 所示。超过70℃时，叶绿素提取率达到较高水平，90℃时提取率最高。因此在接下来的研究中采用90℃进行叶绿素的热DMF提取。

图1 温度对小球藻叶绿素提取的影响Fig.1 Effect of temperature on the chlorophyll extraction from Chlorella

2.2 热提取法的最佳浸泡时间

为了找到最佳浸泡时间，采用热DMF 法在不同时间分别测定了小球藻提取液的叶绿素浓度（图2）。结果表明，向样品中加入热DMF可迅速溶出叶绿素，经过仅1 min的热浸泡，DMF便提取出小球藻中的大部分叶绿素，在第5 min 时，DMF 的叶绿素浓度达到最高。随着提取时间的延长，叶绿素浓度不再升高，结合小球藻沉淀泛白，表明藻细胞中的叶绿素已提取完全。

对叶绿素的有效提取应当确保叶绿素较少分解，因此我们研究了叶绿素在热DMF中的稳定性。虽然叶绿素在热DMF 中随时间缓慢降解，但在10 min 和20 min内降低的百分比分别为1.85%和3.18%（图3），该结果表明叶绿素在热DMF中具有良好的稳定性。

图2 不同浸泡时间内热DMF从小球藻中提取的叶绿素浓度Fig.2 The chlorophyll concentration of hot DMF extracted from Chlorella during different soaking time

图3 叶绿素在90℃DMF中不同保温时间内的浓度，星号（＊）表示与对照（0分钟）相比有显著差异（p<0.05）Fig.3 The concentration of chlorophyll in DMF at 90℃for different incubation times.The star mark（＊）means significant difference（p<0.05）compared with the control（0 min）

2.3 不同热溶剂法的提取效率比较

小球藻是一种难于提取叶绿素的材料，本实验以小球藻为研究材料，根据表1的操作步骤，对热乙醇、热丙酮与热DMF 的叶绿素提取效率进行了比较（图4）。结果显示，三种热溶剂法提取效率存在显著差异，其中热DMF（90℃）具有最高的提取效率，热乙醇法的提取效率次之，热丙酮法效果最差。采用热DMF 提取完成后的藻沉淀已泛白，表明叶绿素提取较为彻底；热乙醇和热丙酮均无法从小球藻中完全提取出叶绿素（最终藻沉淀仍呈深绿色）。

图4 不同热溶剂法对小球藻叶绿素提取效率的比较，柱形图上的不同字母表示差异显著（p<0.05）Fig.4 Comparison of extraction efficiency of Chlorella chlorophyll by different hot solvent methods.Different letters on the bar chart indicate significant differences（p<0.05）

2.4 不同热溶剂法的精密度比较

精密度（变异系数）是评估实验方法有效性的重要指标。根据对样品的检测数据，本研究计算了三种热提取法的标准偏差变异系数（表2），其中热DMF提取法的数值最小，表明该法的精密度最好，测定结果更准确。由于DMF 的沸点达153℃，远高于乙醇和丙酮的沸点，因此挥发性更低，在实验操作中的溶剂损失更少，误差更小，这可能是热DMF法拥有更高精密度的原因。

表2 三种热溶剂法提取叶绿素的精密度评价Tab.2 Evaluation of precision of chlorophyll extraction with different hot solvent methods

3 讨论

较高的温度有利于有机溶剂提取藻类叶绿素，促进细胞膜和细胞壁的破坏、蛋白质的变性，并增加有机溶剂的渗透性。DMF的沸点高达153℃，远高于丙酮的沸点56.5℃和乙醇的沸点78.3℃，为提取叶绿素提供了更高的温度范围。蛋白核小球藻是一种难于提取叶绿素的材料，在本研究中，采用90℃及以上的温度有利于热DMF法获得更好的提取效率。

叶绿素在较高温度的溶液中不可避免地会发生降解[11]。叶绿素在DMF 中具有良好的稳定性，在冷DMF中可保存一个月以上[13]。本研究发现在90℃的DMF中，叶绿素浓度在10 min 内仅下降了1.85%，损失率很低，基本不影响检测结果。本研究还测试了在热DMF中添加MgCO3以防止叶绿素被酸降解，但没有观察到明显的积极效果（数据未列出）。

与传统方法相比，热DMF 方法显示了其优越性。首先，传统方法中的叶绿素提取是一个耗时的过程，需要半天甚至过夜（表3），而热DMF 只用了不到10 min（包括在冷水中的冷却时间）；其次，热DMF法拥有更高的精密度，检测误差较小；最后，对于难处理的藻类材料，热DMF法具有更强的叶绿素提取能力。

表3 不同方法提取叶绿素的时间消耗情况Tab.3 Time consumption for chlorophyll extraction with different methods

综上所述，改进的热DMF 法是一种高效的藻类叶绿素提取方法，特别适合处理具有提取抗性的藻类材料。