miR-152通过HLA-G/KIR2DL4通路对人正常滋养细胞中基质金属蛋白酶2、9表达的影响

杨洋，马媛，宋姗姗，陈宥艺，张建华

子痫前期(preeclampsia，PE)为妊娠期特有疾病，可导致严重母儿并发症[1]，多发生于妊娠20周后，目前发病机制尚未明确。微小RNA[2]、微环境介质[3]、免疫[4]等领域的大量研究，逐步验证了滋养细胞侵袭障碍-引发胎盘灌注不良-最终导致母体微环境紊乱这一病因学说的可能性[5]。而妊娠早期发生于结构复杂且功能调节方式精密的母胎界面中的异常改变，在PE的发病过程中成为关键因素[6]。蜕膜NK细胞(decidual natural killer，dNK)则在母胎界面中，通过分泌多种细胞因子，参与滋养细胞功能的调节过程[7]，在PE发病中发挥作用。

我们前期发现，在PE胎盘组织中病理性高表达的miR-152能够影响dNK分泌功能，影响滋养细胞浸润[8]，但具体机制尚未明确。因此，本研究拟在前期基础上进一步探讨miR-152是以何种方式，通过其靶基因人类白细胞抗原G(human leukocyte antigen-G，HLA-G)的介导，协同dNK参与对滋养细胞浸润的影响。

1 材料和方法

1.1 临床样本

收集2020年9月至2020年10月在西安市第四医院妇产科门诊行人工流产患者的早孕蜕膜组织5例。纳入排除标准：患者年龄<35岁，体质量指数(body mass index，BMI)≤25 kg/m2，均为1胎正常顺产、第2次妊娠因主观无生育要求而终止妊娠的患者；所有患者既往无遗传性、传染性疾病及代谢性疾病病史；无妊娠期疾病史；无孕早期药物、放射线及毒物接触史。本研究经医院伦理委员会批准，所有患者均签署知情同意书。

1.2 主要试剂和材料

人滋养细胞株(HTR-8)(空军军医大学唐都医院妇产科实验室惠赠)。RPMI1640培养基、胎牛血清(FBS)、青霉素-链霉素、磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline，PBS)(美国Gibco公司)；miR-152前体及对照分子(中国吉玛生物公司)；TRIzol、lipofectamine2000、CD56、CD16单抗(美国Invitrogen公司)；基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMP)2、MMP9、β-actin单抗、HRP标记的二抗(武汉博士德生物工程有限公司)；外周血淋巴细胞分离液试剂盒(天津灏洋生物科技公司)；RT-qPCR试剂(美国VAZYME公司)；matrigel胶、Transwell inserts(美国Costar公司)；杀伤细胞免疫球蛋白样受体(killer Ig-like receptors，KIR)2DL4单克隆抗体(anti-KIR2DL4)、IgG1同种型对照(美国Abnova公司)；重组人IL-15(美国PeproTech公司)。

1.3 方法

1.3.1 干预HLA-G/KIR2DL4通路共培养体系的建立 将HTR-8接种于含10%FBS、1%青霉素-链霉素的RPMI 1640培养基中，37℃、5%CO2饱和湿度条件下培养；待细胞生长密度至80%左右时按照Lipofectamine2000说明书要求在HTR-8细胞中过表达与抑制miR-152，获得miR-152mimics组、miR-152inhibitor组、未转染组HTR-8细胞；转染后6 h观察转染效率，48 h后qRT-PCR检测miR-152过表达与抑制水平。

37℃ 5% CO2饱和湿度条件下，消化剪碎的蜕膜组织；按照试剂盒说明书步骤进行淋巴细胞分离并计数；PBS液重悬分离后细胞，并添加CD16和CD56，上流式细胞仪检测分析；最终得到分离纯化后的dNK细胞。

向完成miR-152转染的各组HTR-8(选择6孔板进行)细胞中分别加入1×106个dNK共培养，同时每组加入20 ng/mL的IL-15(仅刺激dNK细胞活性，不影响细胞功能)；部分实验组加入20 μL anti-KIR2DL4或1μg IgG1(为anti-KIR2DL4的对照物质，应用目的为排除anti-KIR2DL4本身是否对细胞功能产生影响及评判其特异性封闭效果)，37℃、5%CO2培养箱中培养48 h后进行后续实验。实验共分6组：NC(对照)组：HTR-8+dNK+IL-15；A组：HTR-8(miR-152mimics)+dNK+IL-15；B组：HTR-8(miR-152inhibitor)+dNK+IL-15；C组：HTR-8(miR-152mimics)+dNK+anti-KIR2DL4+IL-15；D组：HTR-8(miR-152mimics)+dNK+IgG1+IL-15；E组：HTR-8+(miR-152 mimics NC)+dNK+anti-KIR2DL4+IL-15。

因PE病理性胎盘组织中miR-152为病理性高表达，故上述分组中仅设置了miR-152mimics NC。

1.3.2 qRT-PCR检测HTR-8中miR-152转染效率 转染后48 h使用TRIzol法提取miR-152转染后的各组HTR-8细胞总RNA，并检测质量。按照反转录试剂盒说明书将总RNA反转录合成cDNA，再以cDNA为模板进行RT-PCR扩增。引物序列：miR-152(上游5‘-TGCGCTCAGTGCATGACAGAA-3’；下游5‘- CCAGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3’)；U6(上游5‘-CGCTTCGGCAGCACATATAC-3’；下游5‘-AAATATGGAACGCTTCACGA-3’)；反应条件：50°C 2 min，95°C 10 min；95°C 30 sec,60°C 30 sec，40 个循环。以U6为内参，进行PCR反应。每次检测设定3个复孔，每个样本重复3次。根据PCR扩增曲线，使用2-△△Ct法计算各组中目的基因miR-152水平的表达情况。

1.3.3 qRT-PCR及Western blot检测各组HTR-8中MMP2、MMP9表达情况 按照1.3.2中方法提取共培养后各组HTR-8细胞中总RNA，并行qRT-PCR实验。引物序列：MMP2(上游5‘-ACCACAGCCAACTACGATGA-3’；下游5‘-GCTCCTGAATGCCCTTGATG-3’)、MMP9(上游5‘-CAGTCCACCCTTGTGCTCTTCCCTG-3’；下游5‘-ATCTCTGCCACCCGAGTGTAACCA-3’)；β-actin(上游5‘-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3’；下游：5‘-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3’)；反应条件：50°C 2 min，95°C 10 min；95°C 30 sec,60°C 30 sec，40 个循环。以β-actin为内参，进行PCR反应。每次检测设定3个复孔，每个样本重复3次。根据PCR扩增曲线，使用2-△△Ct法计算各组中目的基因MMP2、MMP9 mRNA水平的表达情况。

转染后48 h提取各组HTR-8细胞总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，以40 μg蛋白上样量进行电泳分离，转膜至聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride,PVDF)上，封闭1 h；加抗MMP2(1∶1 000)、抗MMP9(1∶1 000)、抗β-actin(1∶500)抗体，4℃ 孵育过夜，TBST洗膜后加二抗(1∶50 000)，室温孵育2 h。洗膜后，进行化学发光反应，X光胶片压片后显影、定影，冲洗胶片；随后扫描胶片，用BandScan分析胶片灰度值。

1.3.4 Transwell实验 将1.3.1中共培养48 h后的6组共培养上层培养液弃去，PBS漂洗HTR-8细胞，0.25%胰酶消化收集，离心后PBS再次润洗两次；无血清RPMI 1640培养基重悬细胞，稀释细胞浓度至3×105个细胞/mL；Transwell上室分别接种200 μL各组细胞悬液，37℃，5% CO2培养箱培养48 h；70%冰乙醇溶液固定细胞1 h； 0.5%结晶紫染液染色，显微镜下观察拍照；每个滤膜随机选取5个视野，计数下层细胞并行统计学分析。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 miR-152的转染效率

转染后6 h于荧光显微镜下观察转染效率(羧基荧光素酶标记对照)，可见转染效率超过90%，见图1(彩插1)。qRT-PCR结果显示：与未转染组相比，miR-152 mimics组细胞中miR-152表达水平显著升高(P<0.001)，miR-152 inhibitor组细胞中miR-152表达降低(P<0.005)，以上差异均有统计学意义，miR-152在HTR-8细胞中转染效果较好，详见表1。

表1 miR-152在HTR-8细胞中表达水平

2.2 分离、纯化后的dNK细胞情况

dNK细胞表型为CD56+CD16-，流式细胞分选结果显示，分离纯化的dNK细胞纯度较高，约97.08%，见图2。

图2 流式细胞分选dNK纯度

2.3 干预HLA-G/KIR2DL4通路共培养后HTR-8细胞中MMP2、MMP9的表达情况

qRT-PCR和Western blot 结果显示，与NC(对照)组比较：C组(封闭KIR2DL4抗体联合过表达miR-152)HTR-8中MMP2、MMP9在mRNA和蛋白水平均降低(P<0.05)；A组、D组、E组均在过表达miR-152的前提条件下，这3组HTR-8中MMP2、MMP9在mRNA和蛋白水平均分别低于NC组(P<0.05)；B组(抑制miR-152表达)HTR-8中MMP2、9在mRNA和蛋白水平均高于NC组(P<0.05)，见图3、下页表2。

图3 6组HTR-8细胞中MMP2、9在蛋白水平的表达情况

表2 6组HTR-8细胞中MMP2、MMP9在mRNA和蛋白水平的表达情况

2.4 干预HLA-G/KIR2DL4通路共培养后HTR-8浸润能力情况

Transwell 结果显示，与NC(对照)组比较：C组(封闭KIR2DL4抗体联合过表达miR-152)HTR-8细胞浸润能力降低(P<0.05)；A组、D组、E组均在过表达miR-152的前提条件下，这3组HTR-8细胞浸润能力均分别低于NC组(P<0.05)；B组(抑制miR-152表达)HTR-8细胞浸润能力高于NC组(P<0.05)，见图4、表3。

图4 共培养后各组HTR-8浸润能力情况(200倍镜下)

表3 6组共培养后对HTR-8浸润能力的影响

3 讨论

PE为妊娠期造成母儿不良结局的常见原因，其发病率较高[9]。包括滋养细胞浸润障碍及继发的螺旋动脉重铸不足在内的母胎界面中诸多异常改变，初步解释了后期PE特征性临床表现产生的部分病理生理机制[10]。胎盘娩出，PE即可消失[11]，提示母胎界面综合因素在PE发病中的重要作用。而PE的发生源自由蜕膜基质细胞、蜕膜免疫细胞和滋养细胞组成的母胎界面[12]。

dNK作为母胎界面中重要的免疫细胞组分，能够受到miRNA的间接调控，通过影响滋养细胞功能，与复发性流产、PE等发病相关[8,13]。我们前期发现，在PE胎盘组织中病理性高表达的miR-152能够在mRNA及蛋白水平负性调控HLA-G[8]；此外，我们还发现：过表达miR-152的HTR-8与dNK共培养上清中白细胞介素8(interleukin 8，IL-8)、干扰素诱导蛋白10(interferon induced protein10，IP-10)表达降低，且该组共培养上清液可抑制滋养细胞浸润，但具体机制不明[8]。

主要分布于母胎界面的绒毛膜外滋养细胞表面HLA-G，可作为KIR2DL4的唯一配体，通过与其特异性结合传递免疫信号；KIR2DL4为KIR家族成员，同时发挥活化NK细胞分泌细胞因子和趋化因子，及抑制激活NK细胞的细胞杀伤作用；HLA-G与KIR2DL4的结合则会促进NK细胞分泌功能，抑制其杀伤活性，从而有利于维系正常妊娠[14-15]。结合既往研究推测：PE情况下病理性高表达的miR-152能否因对其靶基因的负向调控作用，导致HLA-G低表达，降低了其与dNK细胞表面KIR2DL4受体的正常结合率；通过HLA-G/KIR2DL4通路进一步影响dNK分泌细胞因子(如IL-8、IP-10等)，调节了滋养细胞浸润能力改变过程。

因此，本研究中我们进一步构建了6组过表达与抑制miR-152的HTR-8和dNK的共培养体系，且在共培养过程中特异性封闭KIR2DL4受体；后续实验发现：在与dNK共培养条件下，封闭KIR2DL4抗体后，过表达miR-152的HTR-8浸润能力降低，且该组细胞中MMP2、MMP9在mRNA和蛋白水平均降低；另外3组在过表达miR-152的前提条件下，HTR-8浸润能力均分别低于对照组，且3组HTR-8中MMP2、MMP9在mRNA和蛋白水平也均分别低于对照组；抑制miR-152表达的HTR-8浸润能力高于对照组，该组细胞中MMP2、MMP9在mRNA和蛋白水平均增高；提示共培养条件下，滋养细胞中MMP2、MMP9在mRNA和蛋白水平表达均有改变，细胞浸润能力降低与滋养细胞中MMP2、MMP9表达下降相关。

MMPs表达水平与滋养细胞的浸润及迁移直接相关，其中MMP2、MMP9还可通过细胞膜钙、钾离子通道影响血管内皮舒缩功能[16]。IL-8、IP-10则能够通过与滋养细胞表面趋化因子受体1和3(CXCR3、CXCR1)相互作用，促进MMP2、MMP9合成释放，增强滋养细胞侵袭力[17]。PE时，miR-152介导下的一系列病理改变，可能抑制了IL-8、IP-10水平，进而降低MMP2、MMP9合成，影响滋养细胞正常浸润。以上研究结果能够进一步解释本研究中发现的共培养条件下滋养细胞浸润功能改变的部分机制。母胎界面中，IL-8、IP-10分别影响MMP2、MMP9合成的程度及具体方式，以及dNK分泌的其他细胞因子是否也参与了上述过程，是我们后续继续探究的方向。

综上提示：miR-152可能通过HLA-G/KIR2DL4通路，影响dNK分泌功能，使母胎界面微环境中相关细胞因子发生改变，影响滋养细胞中MMP2、MMP9合成，进而降低滋养细胞浸润能力，诱发后续胎盘血管重塑形成障碍，最终导致PE发生。通过本研究，为PE的病因学研究和临床防治提供了部分实验和理论依据。