慢性心力衰竭气虚血瘀证模型大鼠粪便代谢组学研究

吕李飞，魏孝钦，童丽，赵成周，徐卫松，李忠宽，贾守宁，祁永福

1.青海大学，青海省糖脂代谢疾病防控中医药重点实验室，青海 西宁 810016；2.青海大学藏医学院，青海 西宁 810001；3.华大基因，广东 深圳 518083；4.青海省中医院，青海 西宁 810012

慢性心力衰竭（chronic heart failure，CHF）是一种复杂的临床综合征，表现为神经-内分泌功能激活和外周血流分布异常，其发病率高、预后差，是多种心血管疾病如冠心病、高血压等主要致死原因。中医认为，气虚血瘀是心力衰竭形成的基本病机，气虚日久伴有阳虚，阳少则内寒生，内寒又易招致外寒，使病情恶化。

代谢组学通过整合差异代谢物与疾病病理变化的复杂调控网络，能发现并阐明治疗CHF的物质基础，具有整体、动态、全面的特点，不仅能系统、整体研究中医证候，而且与中医辨证观不谋而合。因此可作为研究CHF气虚血瘀证的切入点。本实验运用液相色谱-质谱（LC-MS）联用技术对CHF气虚血瘀证大鼠粪便代谢物进行研究，初步探讨CHF气虚血瘀证的潜在生物标志物，并进行相关通路关联分析，从代谢组学角度阐明CHF气虚血瘀证的本质，辅助CHF的中医治疗。

1 材料与方法

1.1 动物

SPF级雄性SD大鼠40只，6周龄，体质量（200±20）g，西安交通大学医学部实验动物中心提供，动物生产许可证号SCXK（陕）2018-001。饲养于青海大学医学院动物房，使用许可证号SYXK（青）2020-0001，室温23～25 ℃，光照/黑暗12 h，适应性饲养1周后进行实验。本实验经青海省中医院伦理委员会审批（qhszyy1103201901）。

1.2 药物与试剂

盐酸异丙肾上腺素（货号S31064），上海源叶生物科技有限公司；胎牛血清（货号G8001），武汉赛维尔生物科技有限公司；甲醇（货号A454）、乙腈（货号A998），美国赛默飞有限公司；甲酸（货号50144），北京迪科马科技有限公司；大鼠脑钠肽（BNP）ELISA试剂盒（货号E-EL-R0126c），武汉伊莱瑞特生物科技有限公司。

1.3 主要仪器

2777C液相色谱仪、Xevo G2-XS QTOF质谱仪，美国Waters公司；Milli-Q纯水仪，广州东锐科技有限公司；ECLIPSE Ci-L 正置光学显微镜，日本尼康公司；Pannoramic DESK 全景切片扫描仪，匈牙利3DHISTECH公司；ZS3 Exp型小动物彩色多普勒超声诊断仪，深圳迈瑞公司。

1.4 分组及造模

40只大鼠按随机数字表法分为空白组10只、实验组30只。实验组采用皮下多点连续注射异丙肾上腺素10 mg/kg诱导CHF模型，连续14 d，每日称量大鼠体质量，调整给药剂量。空白组注射等量生理盐水。造模期间观察并记录大鼠一般情况。

给药结束后次日对所有大鼠行超声检测，检测前禁食水12 h，参考文献[4-5]标准判断CHF模型造模是否成功。基于“以方测证”理论及《基于中西医临床病症特点的心力衰竭动物模型分析》验证造模方法是否符合气虚血瘀证动物模型标准。剔除死亡及未成模的5只大鼠，从25只成模大鼠中随机抽取10只作为模型组。

1.5 检测指标

1.5.1 超声检测

大鼠左胸部脱毛处理，异氟烷吸入麻醉，彩色多普勒超声检测左室射血分数（LVEF）、左室收缩末期内径（LVESd）、左室舒张末期内径（LVEDd），连续测量3 个心动周期，计算左室短轴缩短率（LVFS）。LVFS（%）=（LVEDd－LVESd）÷LVEDd×100%。

1.5.2 血清脑钠肽检测

20%乌来糖腹腔注射（0.8 mL/100 g）麻醉大鼠，仰卧位固定于手术台上，腹主动脉采血，常温静置2 h，4 000 r/min离心10 min，取上层血清，按ELISA试剂盒说明书操作步骤检测BNP含量。

1.5.3 HE染色

取大鼠心肌组织，生理盐水冲洗，置于4%多聚甲醛溶液中固定，修剪，脱水，浸蜡，包埋，切片，行HE染色，封片，显微镜下观察心肌组织病理改变。

1.5.4 粪便代谢组学检测

将大鼠分别置于代谢笼中收集24 h 粪便，精密称取25 mg粪便置于EP管中，加入800µL预冷的沉淀试剂（甲醇∶乙腈∶纯水＝2∶2∶1），研磨机研磨（60 Hz，4 min），冰浴超声（80 Hz，10 min），混合成匀浆。加入胎牛血清，封膜后震荡摇匀，置于-20 ℃冰箱过夜。4 ℃、25 000×离心15 min，取600µL上清液再次离心，吸取上清液，冷冻抽干机抽干，加入600 μL 10%甲醇复溶，冰浴超声（80 Hz，10 min），4 ℃、25 000×离心15 min，从空白组和模型组各样品中取50 μL 混合，制成质控（QC）样品（总体积为1 mL），取60 μL上清液转移至96孔微孔板，进行封膜标识、上机检测。

液相色谱条件：ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流动相为水-0.1%甲酸（A）、甲醇-0.1%甲酸（B），梯度洗脱（0～2 min，100%A； 2～11 min， 100%～0%A； 11～13 min，0%A；13～15 min，0%～100%A）；柱温50 ℃，流速0.4 mL/min，进样量5µL。

质谱条件：采用高分辨质谱对色谱柱洗脱下来的小分子物质进行正、负离子模式采集。正离子模式：毛细管电压3.0 kV，锥孔电压40.0 V；负离子模式：毛细管电压2.0 kV，锥孔电压40.0 V。MSE模式进行数据采集，一级扫描范围50～1 200 Da，扫描时间0.2 s，以20～40 eV的能量对所有母离子进行碎裂，采集所有碎片信息。在数据采集过程中，每3 s对LE信号进行实时质量校正。同时，每隔10个样品进行一次QC样品的采集。

1.6 数据处理

将质谱原始数据导出为Rawdata.tar 格式，利用Progenesis QI 2.2 进行峰提取，获取相对标准偏差（RSD）≤30%的离子，QC-RSC法校正。将数据导入metaX软件进行主成分分析（PCA）和偏最小二乘-判别分析（PLS-DA），多变量选取PLS-DA模型变量投影重要性（VIP）≥1的主成分，结合单变量分析差异倍数（FC）≥1.2 或≤0.833 3 和q-value＜0.05，三者取交集得到差异代谢物。最后基于KEGG（https://www.kegg.jp/）、人类代谢组学数据库（HMDB，https://hmdb.ca）对代谢物进行注释。

1.7 统计学方法

2 结果

2.1 中医证型评价

模型组大鼠扎堆，活动减少，体质量减轻，食少，毛发凌乱、黄脆易掉，胞睑下垂、无神呆滞，舌有瘀点，唇黯爪青，阴囊脱出，尿少，行超声备皮前可见颈部青筋暴露，抓捕时易见甲掉出血，甚则全胸部触之如石、满胸积液。参照“1.4”项下评价标准，结果显示本研究模型大鼠与气虚血瘀证相符。

2.2 心脏超声结果

与空白组比较，模型组大鼠LVEF、LVFS显著降低（＜0.01），符合CHF大鼠造模评价标准。见表1。

表1 2组大鼠心脏超声指标比较（，%）

2.3 模型大鼠血清脑钠肽变化

与空白组比较，模型组大鼠血清BNP含量显著增加，差异有统计学意义（＜0.01）。见表2。

表2 2组大鼠血清BNP含量比较（，pg/mL）

2.4 模型大鼠心肌组织病理变化

空白组大鼠心肌纤维结构正常、分界清晰、排列规则，间质未见明显异常，无炎症浸润；模型组大鼠心肌组织可见大量纤维水肿，胞质疏松淡染（黑色箭头），组织边缘可见心肌纤维溶解，被增生的结缔组织取代（黄色箭头），伴有少量淋巴细胞浸润（红色箭头）。见图1。

图1 2组大鼠心肌组织形态观察（HE染色，×100）

2.5 多元统计分析

QC样品总离子流图（见图2）重叠度高，表明本实验建立的分析方法稳定，重复性好，结果可靠。PCA主要用于观察组间分离趋势，反映组间和组内的变异度。由图3可知，与空白组比较，模型组大鼠粪便代谢物产生了一定变化；PLS-DA得分（见图4）显示，2组差异有显著分离趋势。使用metaX软件建立模型组与空白组的PLS-DA模型，R和Q越接近1表明模型拟合越好。对R和Q进行置换检验（＝200），R＝0.95，Q截距＜0，表明本研究建立的模型有效，可用于CHF 气虚血瘀证模型粪便差异代谢物的筛选。见图5。

图2 QC样品总离子流图

图3 2组大鼠粪便代谢物PCA得分

图4 2组大鼠粪便代谢物PLS-DA得分

图5 2组大鼠粪便代谢物PLS-DA模型验证

2.6 差异代谢物筛选结果

按“1.6”项下筛选方法，将差异代谢物按VIP值大小排序，结合q-value及FC，共筛选出19种差异代谢物，主要包括3-磷酸肌醇、牛磺胆酸、二氢小檗碱、苯丙酮酸、月桂酸等（见表3），以log（FC）为横坐标、-lg（q-value）为纵坐标绘制火山图，见图6。其中3-磷酸肌醇、二氢小檗碱、海藻氨酸、8-羟基腺嘌呤、羟基半乳糖等代谢物水平升高，牛磺胆酸、硒甲基硒代半胱氨酸、苯丙酮酸、月桂酸及槲皮素3-(6”-槐花苷)等代谢物水平降低。

图6 CHF气虚血瘀证大鼠粪便差异代谢物火山图

表3 CHF气虚血瘀证大鼠粪便潜在差异代谢物

采用R语言的pheatmap函数对筛选出的差异代谢物进行聚类分析，得到差异代谢物热图（见图7）。图中每一行代表一个差异代谢物，每一列代表一个样品，不同颜色表示强度，颜色从绿色到红色表示强度由低到高。

图7 CHF气虚血瘀证大鼠粪便差异代谢物热图

2.7 差异代谢物分类和功能注释

采用HMDB及KEGG数据库对差异代谢物进行分类和功能注释，明确差异代谢物的相关代谢途径及信号通路。本研究筛选出的差异代谢物主要包括氨基酸、嘌呤类、糖脂类及黄酮类等，主要代谢途径涉及苯丙氨酸代谢、黄酮类代谢、能量代谢、糖脂代谢及胆汁酸代谢等，功能注释主要涉及酪氨酸和色氨酸合成、膜转位、信号通路转导等。见图8。

图8 CHF气虚血瘀证大鼠粪便差异代谢物KEGG功能注释

3 讨论

异丙肾上腺素能加快大鼠心率，诱导心肌细胞肥大，使其结构紊乱，甚至肌纤维断裂，进而增加心肌耗氧量，加重心脏负荷，最终导致CHF。研究表明，在CHF长期病理发展过程中，由于机体产能、供能不足导致内源代谢物紊乱，而粪便代谢物是机体和肠道微生物协同代谢的结果，因此，基于CHF模型大鼠研究其粪便代谢组学不仅能在整体层面遴选疾病靶标，而且可为中医病证结合的现代化研究提供参考依据。

3-磷酸肌醇、类二十烷酸、葡萄糖醛酸苷是桥接能量和糖脂代谢的重要物质。细胞质内Ca泵的调节机制复杂，受多靶点、多通路调控，但Ca浓度主要依赖3-磷酸肌醇的表达。3-磷酸肌醇作为重要信使，可通过cGMP/PKG通路诱导3-磷酸肌醇钙通道开放及结合受体活化，进而刺激细胞膜引起Ca充电式内流，使位于心肌的TPRV1处于选择性抑制状态，迫使降钙素基因聚合物和P物质感召抑制，打破心肌细胞受保护的模式。类二十烷酸是具有生物活性的脂质分子，在CHF过程中发挥不确定性危害或保护作用，其在炎症状态下容易受嘌呤碱激活，并将激活信号呈递给胞质钙依赖性PLA2，导致促炎性类二十烷酸及正十五烷酸、3-氧代十六烷酸、11Z二十八碳烯酸等可能参与促炎反应的脂类表达升高，促炎性类二十烷酸在心血管疾病中发挥危害作用，不仅能加速心肌细胞内线粒体脂肪酸氧化，而且能合成内源性TPRV1抑制物，参与细胞色素P450氧化。葡萄糖醛酸苷的苷键容易水解产生苷元，通过肠肝循环时被细胞色素P450氧化，引发糖脂代谢失调，最终造成DNA内毒性损伤。上述3种代谢物水平在模型组大鼠粪便中显著上调，一方面可能通过对Ca泵的调控，使葡萄糖氧化程度降低，心肌产能减少；另一方面通过促进血栓素B2及脂氧素A4生成，诱导血小板聚集，降低脂质和胆固醇的溶解性。心肌的能量代谢无法补给机体充足的ATP需求，同时高脂又使血小板内的环氧酶转移，花生四烯酸代谢受阻，从而转向炎性通路代谢，加速CHF症状恶化。

此外，苯丙酮酸、月桂酸也是调节能量代谢的关键物质。苯丙酮酸是机体必需氨基酸苯丙氨酸的中间代谢产物，也是直接参与能量代谢的特征标志物，其多途径拓展细胞色素P450酶的激活，使月桂酸链内羟基化，发挥高水平的康复调节作用，恢复葡萄糖有氧氧化功能，也能有效催化糖酵解，释放更多能量，减轻机体在CHF状态下缺氧和少能的活动障碍。模型组大鼠粪便苯丙酮酸和月桂酸水平降低，提示CHF的能量代谢异常伴随氨基酸代谢紊乱。

牛磺胆酸是胆汁酸和牛磺酸的结合物，广泛参与脂类代谢，能增加胆固醇的溶解性，也能减轻海藻氨酸协同游离胆汁酸产生的细胞毒性。因此牛磺胆酸的代谢障碍会引发胆汁酸水平紊乱。胆汁酸是肠-肝循环的关键物质，可调节肠道内脂质代谢。同时牛磺胆酸可降低三羧酸循环（TCA）中柠檬酸的表达，引起TCA障碍，而TCA是糖类、脂类、氨基酸类的最终代谢通路，也是糖脂代谢、能量代谢、氨基酸代谢紊乱的直接标志。本次研究发现，模型组大鼠粪便牛磺胆酸水平下降，表明模型大鼠出现脂质堆积，心肌细胞能量利用率降低，进而出现扎堆、活动少，精神萎靡，甚则阴囊脱出等表现。

高脱氧胆酸能激活NLRP3炎性小体，使Caspase-1、白细胞介素-1β等内源性炎症因子高表达；扁桃酸能促进增殖细胞核抗原表达，与炎性因子的活跃程度呈正相关；8-羟基腺嘌呤最终代谢生成尿酸，尿酸容易在血管壁沉积，损伤血管内皮细胞；二氢小檗碱易诱发心脏毒性，导致获得性长QT综合征；羟基半乳糖代谢异常可加速线粒体损伤。以上代谢物在模型组大鼠粪便中水平升高，提示模型大鼠出现血管内皮损伤、炎症因子侵噬、心肌能量生成障碍等表现。

既往研究表明，CHF能诱导氧化应激和炎症反应，使心肌细胞内Ca平衡被打破，进而损伤心肌并造成心室肥厚，伴随代谢调控网络失衡。本研究筛选出的差异代谢物槲皮素3-(6”-槐花苷)属黄酮类，能缓解蒽环类药物诱导的心肌Ca超载损伤，其作用机制可能与铁螯合相关。硒甲基硒代半胱氨酸具有抗氧化、抑制凋亡因子作用，能有效保护心血管，有希望成为候选治疗药物。5-羟基吲哚乙酸与膜电位的超极化密切相关，通过cAMP介导的色氨酸代谢能关联CHF的预后。兰尼碱可依赖位于心肌细胞肌浆网上的受体调控钙循环，其受体的激活与cAMP、蛋白激酶Ⅱ相关。上述3种代谢物水平在模型组大鼠粪便中下调，表明在黄酮代谢受干扰的情况下，CHF会引起多元代谢物紊乱，这种病理机制可能与钙循环有关，其具体机制值得进一步深入研究。

综上，本研究通过LC-MS技术筛选出19种CHF气虚血瘀证的潜在差异代谢物，包括氨基酸、嘌呤类、糖脂类及黄酮类等成分，涉及苯丙氨酸代谢、黄酮类代谢、能量代谢、糖脂代谢及胆汁酸代谢等途径，从代谢组学角度初步揭示了CHF气虚血瘀证发病机理。基于本研究结果，后续将采用多组学技术相结合的模式进一步研究该病证的生物学基础，旨在为临床CHF的疗效评估及中医诊治提供实验依据。