钙指示剂修饰电极同时测定嘌呤和嘧啶

刘小娴

(南通市产品质量监督检验所，江苏 南通 226600)

脱氧核糖核酸(DNA)作为一个重要的生物大分子近几年来备受关注。它不仅能够遗传信息，而且其双螺旋结构可以提供一个有效的媒介来供电子转移[1-3]，因此为DNA的检测提供了一个敏感的，准确的，快速的和具有成本效益的平台，在各种实际应用、医疗领域中的诊断、临床遗传分析、法医鉴定和环境监测中具有深刻的意义[4-6]。

迄今为止，人们已经提出了很多化学方法来检测DNA中的嘌呤成分(鸟嘌呤，腺嘌呤等)，如质谱法(MS)，高效液相色谱法(HPLC)，离子对液相色谱法(IPIC)，毛细管电泳法(CE)，流动注射化学发光法(CL)和光谱法等，但是这些方法中存在着很多的不足：耗时，仪器昂贵，灵敏度低，预处理复杂等。相比较之下，电化学的检测方法更为简单、方便、快捷。

钙指示剂(又称铬蓝黑R)是一种偶氮染料。据我们所知，有关钙指示剂的电聚合和应用的文献很少。本文研究了钙指示剂的电聚合以及其在嘌呤和嘧啶测定上的应用。应用了场发射扫描电镜(FESEM)对电极表面的聚钙指示剂膜进行了表征。基于聚钙指示剂膜修饰玻碳电极对鸟嘌呤，腺嘌呤，胸腺嘧啶和胞嘧啶的不同电催化活性，建立了能同时测定嘌呤和嘧啶的灵敏度高、选择性好的电化学方法，并成功用于DNA样品的检测中，结果令人满意。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

DNA Calf Thymus(Sigma)，鸟嘌呤(guanine)、腺嘌呤(adenine)、胸腺嘧啶(thymine)、胞嘧啶(cytosine)，国药集团化学试剂有限公司；钙指示剂，中国上海化学试剂公司；CHI电化学工作站660D，上海辰华仪器公司；S-4800场发射扫描电子显微镜，Hitachi，日本。

1.2 DNA样品的制备

根据之前的报道[7]，称取鲑鱼精DNA 12.0 mg，加入600 μL甲酸88%(w/w)在封闭的试管中于170 ℃下加热30 min。水解产物用2.0 M NaOH溶液调节到中性，然后用蒸馏水稀释。即得到DNA样品。

1.3 钙指示剂修饰玻碳电极的制备

将预处理好的玻碳电极再置于含25 mmol/L钙指示剂磷酸盐缓冲溶液中(pH=5.0)中，于-0.8～+1.4 V范围内，以 100 mV/s的扫描速度循环扫描5圈，即可制得聚钙指示剂膜修饰电极。

2 结果与讨论

2.1 钙指示剂聚合的循环伏安曲线

图1为钙指示剂在以0.1 mol·L-1磷酸盐缓冲液(pH=5.0)为介质，于-0.8～+1.4 V电位范围内，在100 mV·s-1扫速条件下电聚合5圈最佳聚合条件下的循环伏安曲线图。从图中可以看出，第一圈循环伏安曲线扫描时在0.189 V出现一很强的氧化峰，从第二圈开始，氧化峰电流开始减少，5圈后达到稳定。这一现象表明，聚钙指示剂膜已被聚合到玻碳电极的表面。

扫描电位：-0.8～+1.4 V；扫描速率：100 mV/s；扫描圈数：5圈

2.2 修饰电极的电化学表征

图2是聚钙指示剂膜修饰电极的扫描电镜图。从图中可以看出，聚合后电极表面形成了一层褶皱状的膜，说明钙指示剂已经聚合到电极表面。

图2 聚钙指示剂膜修饰电极和裸电极的扫描电镜图

2.3 G， A， T， C在钙指示剂修饰电极上的电化学行为

图3研究了含有50 μM嘌呤和100 μM嘧啶的PBS(pH 6.0)混合溶液在裸电极和钙指示剂修饰电极上的电化学氧化行为。曲线a显示了裸电极测定时两个弱而宽的氧化峰，G和A的电位分别在0.688 V，0.988 V左右。由于电子转移动力学的改善，曲线b中氧化电流增加到1.5倍左右，并且G和A，A和T，T和C之间的峰间距分别为296 mV，184 mV，152 mV，四个物质的氧化峰得到很好的分离。

图3 50 μM G(A)，50 μM A(B)，100 μM T (C)，100 μM C (D)，50 μM G，A 和100 μM T，C混合溶液(E)在pH值为6.0 PBS中的裸电极(a)和聚钙指示剂膜修饰电极(b)上的示差脉冲伏安图

2.4 测定底液的选择

考察了鸟嘌呤，腺嘌呤，胸腺嘧啶和胞嘧啶在不同的支持电解质中如HCl，H2SO4和不同的缓冲溶液中(HAc-NaAc， KCl， NH4Cl-NH3·H2O)的示差脉冲伏安图。实验结果表明：鸟嘌呤，腺嘌呤，胸腺嘧啶和胞嘧啶在磷酸缓冲溶液溶液中可以得到最灵敏和峰型最好的电流响应图。因此，本实验选用磷酸缓冲溶液为测定底液。

2.5 底液pH的影响

以PBS为底液，在pH 2.0～9.0的范围内，底液的pH值不仅改变G的氧化峰电流，而且改变其氧化峰电位。G和A的氧化峰电流在pH=3.0时达到最大，T和C在8.0和6.0左右达到最大。综合考虑，因此选择pH=6.0的PBS作为同时测定这四种物质的底液。

2.6 扫速的影响

通过循环伏安曲线考察了50 μM G，A 和 100 μM T ，C的峰电流跟扫描速度的关系。在10～300 mV·s-1的范围内，G峰电流与扫描速度的平方根成正比，其线性回归方程为I(μA)=0.4457v1/2(mV/s)+0.1759，(r=0.9954)，表明G在修饰电极上受扩散控制的过程。A，T和C的峰电流同样都与扫描速度的平方根成正比，其线性回归方程分别为：I(μA)=0.4705v1/2(mV/s)-0.7035，(r=0.9949)；I(μA)=0.1155v1/2(mV/s)+0.2348，(r=0.9969)； I(μA)=0.2926v1/2(mV/s)-0.4960， (r=0.9983)。表明A，T和C在修饰电极上也都是受扩散控制的。

G concentrations (from 1 to 10)：1.5， 3， 7.5， 17.5， 25， 40，50， 60，70 and 80 μM. A concentrations (from 1 to 10)： 1， 5， 20， 35， 40， 50，60，70， 80 and 90 μM. T concentrations(from 1 to 10)： 1.5， 5， 10，30， 50， 85， 100， 150， 180 and 200 μM. C concentrations (from 1 to 11)：1.5， 5， 10， 20， 30， 40， 50， 60， 70 and 80 μM

2.7 线性范围及检出限

钙指示剂修饰电极能够很好地用于混合溶液中鸟嘌呤，腺嘌呤，胸腺嘧啶和胞嘧啶含量的同时测定。鸟嘌呤，腺嘌呤，胸腺嘧啶和胞嘧啶的氧化峰电位分别为0.680 V，0.964 V，1.176 V和1.308 V。图4表示了0.1 M pH 6.0的磷酸盐缓冲溶液中不同浓度的鸟嘌呤，腺嘌呤，胸腺嘧啶和胞嘧啶共存时用示差脉冲伏安法测得的曲线，曲线表示随着浓度的增加，鸟嘌呤，腺嘌呤，胸腺嘧啶和胞嘧啶的氧化信号不断增强。另外，鸟嘌呤，腺嘌呤，胸腺嘧啶和胞嘧啶的电化学信号所对应的氧化峰电位之间的间隔为296 mV，184 mV和152 mV，足够用于它们的同时测定。鸟嘌呤的氧化峰电流和浓度在3～80 μM范围内呈比例关系，线性回归方程为：ip(10-6A)=3.1946+0.0535 C(10-6mol·L-1),R=0.9855。通过计算，得出检测限为0.5 μM (S/N=3)。对于腺嘌呤，胸腺嘧啶和胞嘧啶的含量测定，方法情况和鸟嘌呤相似，氧化峰电流和浓度之间的线性关系如表1。

表1 利用示差脉冲伏安法测定DNA碱基的线性方程

2.8 干扰实验

在5%的误差范围内，在含有50 μM鸟嘌呤，50 μM腺嘌呤，100 μM胞嘧啶和100 μM胸腺嘧啶的缓冲溶液中，加入葡萄糖，维生素C，甘氨酸等均无干扰。这表明钙指示剂修饰电极能够有效地排除一般存在的干扰物对鸟嘌呤，腺嘌呤，胞嘧啶和胸腺嘧啶测定的影响。

3 重复性和稳定性

用同一支玻碳电极在相同条件下用钙指示剂修饰4次，然后在0.1 mol·L-1磷酸盐缓冲(PBS)中对鸟嘌呤，腺嘌呤，胸腺嘧啶和胞嘧啶进行测定；再用同一支修饰电极在0.1 mol·L-1PBS中平行测定5次，其RSD分别为1.45%，2.32%，3.7%和3.4%。表明该修饰电极的重现性令人满意。将该修饰电极在室温放置，一周后测定其响应电流变为原来的90%，表明该修饰电极的稳定性可以满足实际应用的需求。

4 DNA样品测定

用钙指示剂修饰电极来检测鲑鱼精DNA中鸟嘌呤，腺嘌呤，胸腺嘧啶和胞嘧啶的浓度。根据氧化峰电流计算可知，鲑鱼精DNA中鸟嘌呤，腺嘌呤，胸腺嘧啶和胞嘧啶的含量分别为40.00， 55.00， 72.50和65.70。因此，计算热变性DNA中(G+C)/(A+T)的值为0.83，接近于标准值0.79。

5 结 论

通过电化学修饰电极的方法制备了一种新型的聚钙指示剂膜电极，本实验采用示差脉冲扣除背景法，利用此修饰电极同时测定了鸟嘌呤，腺嘌呤，胸腺嘧啶和胞嘧啶的含量。实验结果表明该修饰电极对嘌呤和嘧啶有氧化催化作用，应用本法对鲑鱼精DNA样品进行了测定，结果令人满意。