HPLC法同时测定不同产地番红花中4种化合物的含量*

尚严严，李东林

(阜阳职业技术学院，安徽 阜阳 236031)

番红花(学名：CrocussativusL.)又名藏红花、西红花，以其干燥柱头入药，是亚洲西南部原生种，最早在希腊人工栽培。主要分布欧洲、地中海及中亚等地，是一种名贵的中药材[1-2]。明朝传入我国，该药具有散瘀止痛、活血化瘀，散湿去肿之功效，主要用于治经闭、痛经、胸胁刺痛、跌打损伤、疮疡肿痛等症[3]。现代药理研究表明，番红花的特征性成分主要是西红花苷、苦番红花素、西红花酸[4-5]。其中，西红花苷具有抗氧化、降血压、降血脂等作用；苦番红花素具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化应激等作用；西红花酸对心脏、保护海马神经元等有保护作用[6-10]。然而因种植方法、种植区、气候条件等不同，不同产地番红花中药效物质基础存在一定的差异[11]。2020版《中国药典》仅以西红花苷和苦番红花素为指标成分来评价番红花药材质量，相对单一的检测指标对番红花的质量评价存在一定的缺陷[12]。笔者此次收集了不同产区18批番红花，结合《中国药典》拟建立HPLC法测定番红花中西红花苷-I、西红花苷-II、苦番红花素、西红花酸4种功效物质的含量，以期为番红花在皖北合理“安家”提供定性、定量指标，为番红花规范化生产提供科学依据。

1 材 料

1.1 仪器与试药

安捷伦1260型高效液相色谱仪；十万分之一天平，北京赛多利斯科学仪器有限公司；DL-60J智能台式超声波清洗机，上海之信仪器有限公司；西红花苷-I(批号：P0187，纯度≥98%)，上海纯优生物科技有限公司;西红花苷-II(批号：JW10503，纯度≥98%)，上海极威生物科技有限公司;西红花酸(批号：DX0041，纯度≥98%)，成都德思特生物技术有限公司;苦番红花素(批号：JOT-11341，纯度≥98%)，成都普菲德生物技术有限公司；乙腈、甲醇色谱纯，其余试剂均为分析纯。

1.2 供试样品

番红花样品购自安徽省阜阳市阜南县番红花种植专业合作社(编号：FN-1、FN-2、FN-3、FN-4、FN-5、FN-6)、安徽省亳州市谯城区番红花种植户(编号：BQ-1、BQ-2、BQ-3、BQ-4、BQ-5、BQ-6)和浙江建德(编号：ZJ-1、ZJ-2、ZJ-3、ZJ-4、ZJ-5、ZJ-6)。18批番红花样品均经阜阳职业技术学院李东林教授鉴定为鸢尾科植物番红花(CrocussativusL.)的干燥柱头。

2 方 法

2.1 色谱条件

岛津C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相为甲醇-水(含0.1%甲酸)，流速1.0 mL/min；检测波长为：250 nm、430 nm(0.00～15 min，430 nm；15.01～20.00，250 nm；20.01～50.00，430 nm)；柱温为30 ℃，进样量：10 μL，梯度洗脱。

表1 色谱条件

图1 高效液相色谱图

2.2 对照品溶液的制备

取西红花苷-I、西红花苷-II、西红花酸、苦番红花素对照品适量，精密称定，分别置100 mL量瓶中，加弱碱性稀乙醇50 mL溶解，冰浴超声(功率200 W，频率40 kHz)10 min，提取2次，放置室温，弱碱性乙醇定容，依次得浓度为518.1、326.4、181.36、590.4 μg/mL的母液。

2.3 供试品溶液的制备

取样品(编号：FN-1)适量，打成细粉，过筛，称取 20 mg，精密称定，置100 mL量瓶中，加弱碱性稀乙醇50 mL溶解，冰浴超声(功率200 W，频率40 kHz)10 min，提取 2次，放置室温，弱碱性乙醇定容，摇匀，滤过，即得续滤液。

2.4 线性范围的考察

分别移取各母液各0.1、0.3、0.5、0.8、1.0 mL，精密量取，分别置于10 mL量瓶中，加弱碱性稀乙醇溶液至刻度，摇匀，在“2.1”项色谱条件下测定。以西红花苷-I、西红花苷-II、西红花酸、苦番红花素对照品溶液的浓度为横坐标 X，以峰面积为纵坐标 Y，绘制标准曲线。回归方程及线性范围见 表2所示。结果表明，4种化合物在各自浓度范围内线性关系良好。

表2 线性关系考察

2.5 精密度试验

2.5.1 不同日期精密度试验

取同一对照品，在不同日期，在“2.1”项色谱条件下连续进样 6 次，分别测得西红花苷-I、西红花苷-II、西红花酸、苦番红花素峰面积的RSD分别为 0.53%、0.77%、1.12%、0.68%，表明该方法的中间精密度良好。

2.5.2 不同仪器精密度试验

取同一对照品，在不同仪器上，在“2.1”项色谱条件下连续进样 6 次，分别测得西红花苷-I、西红花苷-II、西红花酸、苦番红花素峰面积的RSD分别为 0.65%、0.82%、1.23%、0.93%，表明该方法的中间精密度良好。

2.6 重复性试验

取样品(编号：FN-1)适量，称取样品20 mg，共6 份，精密称定，按“2.3” 项下制备供试品溶液，在“2.1”色谱条件下测定峰面积，计算西红花苷-I、西红花苷-II、西红花酸、苦番红花素平均含量依次是：13.44%、5.81%、1.5%、8.69%；西红花苷-I、西红花苷-II、西红花酸、苦番红花素RSD值分别为：1.15%、1.66%、2.19%、2.29%，说明该方法重复性良好。

2.7 稳定性试验

取供试品(编号：FN-1)溶液，分别于 0、1、4、6、8、12、20 h 进样，记录峰面积，计算RSD值。结果显示，西红花苷-I、西红花苷-II、西红花酸、苦番红花素峰面积的RSD分别为1.19%、0.91%、0.87%、1.03%，表明供试品溶液室温避光保存20h内稳定性良好。

2.8 加样回收率试验

取已知含量的番红花样品(编号：FN-1)，称取10 mg，共 6 份，精密称定，置于100 mL量瓶中，分别加入西红花苷-I、西红花苷-II、西红花酸、苦番红花素对照品适量，按“2.3”项下制备供试品溶液，在色谱条件下测定，计算加样回收率。4种化合物的平均加样回收率及RSD值见表3所示。

表3 4种化合物的加样回收率试验(n=6)

2.9 样品含量测定

取收集的18批番红花样品，分别称取粉末约20 mg，精密称定，按对应方法操作，制备番红花供试品溶液，在色谱条件下测定，测定结果见表4所示。

表4 样品含量测定结果(n =3)

续表4

3 结果与讨论

3.1 提取方式考察

通过借鉴朱亚楠等[13]提取西红花中有效成分的方法，并在此基础之上进行优化，具体如下：因4种目标成分是在同一条件下提取，西红花苷类物质中含有酯键，在温度稍高、超声时间稍长时，则已发生水解，致使目标成分含量减少，测量数据误差增加；西红花酸在2020版《中国药典》条件下溶解性较差，可使其成盐达到增加溶解度目的，使用弱碱性稀乙醇溶液则可事半功倍，故本次试验在低温、超声10 min时，可以达到提取目标成分真实含量的目的。

3.2 色谱条件考察

通过对乙腈-水、甲醇-水、甲醇-甲酸溶液等多个流动相体系进行摸索比较[14-16]，乙腈-水作为流动相，西红花酸与相邻杂质峰之间分离度小于1.5，且乙腈价格较高毒性较大。甲醇-水作为流动相，基线不够平稳，出峰时间较晚。故选择甲醇-0.1%甲酸溶液作为流动相，基线平稳，理论塔板数大于10231，四种成分的分离度大于2.5，峰形对称性较好，可用于目标成分的分离与检测。

3.3 结果分析

为便于直观反映表4不同产地番红花中4种有效物质的含量，采取绘制坐标图的方式进行展示，见图2。

图2 不同产地番红花中4种有效物质的含量

由图2，对比不同产地番红花中4种有效物质的含量，西红花苷-I和苦番红花素含量最高，其次为西红花苷-II，最低为西红花酸。其中，各批番红花中西红花苷-I和西红花苷-II含量之和均超过18%、苦番红花素的含量均超过8.0%，达到2020版《中国药典》规定要求[12]。

阜南产番红花(编号FN-1、FN-2、FN-3)中4种功效化合物含量稍低于其它产地，可能与采收的是一年生番红花有关。此试验排除不同生长年份对番红花中有效物质含量的影响，阜南产(编号FN-4、FN-5、FN-6)药材较少，故本次仅对安徽亳州和浙江建德产番红花进行结果分析。

安徽亳州产番红花中4种功效化合物的含量整体高于浙江建德。经多次实地考察，发现番红花的品质受种植方式、土壤条件、田间肥力、温湿度、降水量等的影响。

浙江建德采取室内外“二段式”种植模式，番红花柱头在室内采收后，种球于11月中下旬栽种于大田，室外生长6个月左右，次年5月地上部分干枯挖出种球，置阴凉通风处贮藏[17]。而安徽亳州采取室外“一段式”种植模式，即当年5月份种球不挖出，套种其它农作物遮阴使种球在地下渡过休眠期，开花期在田间采收柱头。从采摘后的柱头品相观察，建德产番红花优于亳州。但通过本实验，结合前人研究[18]数据分析，亳州产番红花中有效成分的含量高于浙江建德。结果表明，“一段式”和“二段式”种植模式对番红花中有效成分的积累影响不大，且“二段式”生产成本较高，生产上要因地制宜，综合考虑生长环境、品种、劳动力资源和经济情况确定适宜生产模式。

从种植土壤环境分析，浙江建德土质黏重，板结不透气；亳州土壤质地含砂量高，疏松透气，不易积水。李明林等[19]研究表明，砂质土壤更适宜西红花种球的生长，有利于营养成分的积累。

亳州产番红花在种植过程中，多施用有机肥，有机肥中含有大量的有机物质和有益菌，能提供丰富的营养物质，有效改善土壤理化性质。

番红花田间生长忌水涝，浙江建德地处亚热带季风气候区，夏季降雨充沛，温湿度较高，易致室外田间种球腐烂，室内采摘后的番红花中有效成分含量下降；安徽亳州气候处在暖温带南缘，气候温和，光照充足，雨量适中，有利于番红花种球在大田生长。

除上述因素外，如病虫害防治、鲜品加工方式、贮藏都会使番红花有效成分含量发生变化，相关影响因子和效应还需要进一步深入研究，以期为番红花在皖北地区规范化种植提供理论支撑。

此次试验结果，发现西红花酸的含量在不同产地之间差异不明显，可能和本次试验样本量少有关，要使试验结果更准确可靠，需要收集更多数量番红花药材样本，测定番红花中4种功效化合物的含量才更具有地域代表性。

4 结 论

本文采用HPLC法同时测定不同产地番红花药材中4种药效化合物的含量，该方法简便、稳定、重现性好，可用于番红花的质量控制和评价。

目前，HPLC法测定番红花中有效成分含量的研究多集中在不同产地之间的比较以及不同部位之间的比较[14，16，18]，而对其不同生长年份以及不同花期阶段中化学成分含量变化关注较少，为提高番红花的质量，应更加关注番红花生长年限以及花期阶段中化学成分含量的变化，为确定最佳采收时间提供依据。

通过本次试验，可以进一步结合不同产地番红花指纹图谱的构建，来检测番红花中有效成分的种类与数量，从而更全面评价皖北地区番红花的质量，最终为番红花在皖北扩大生产规模，为全面促进乡村振兴和农户创业增收奠定基础。