葛根降血压茶的制备及对自发性高血压大鼠的降压作用

刘 璐 袁亚宏 岳田利,2

(1. 西北农林科技大学食品科学与工程学院，陕西 咸阳 712100；2. 西北大学食品科学与工程学院，陕西 西安 710069)

除医学药物治疗外，茶疗法因人群饮用广泛、购买便利，是预防与治疗高血压的一种很好的辅助方法[1]。从茯砖茶中分离出的冠突散囊菌(EurotiumCristatum)，也称“金花菌”，可以与多种发酵原料相互作用，通过分泌微生物酶使发酵基质具有独特的风味和口感[2-3]。在发酵过程中茶多酚被转化成儿茶素衍生物、黄酮类化合物及其苷类、酚酸类、生物碱类和萜类等多种成分，具有抗高血压、抗氧化、减轻体重、缓解代谢综合征和调节肠道等功效[4]。

绿茶是世界上最受欢迎的饮料之一，含有丰富的生物活性物质，长期饮用绿茶和绿茶产品对人体健康有益，特别是对癌症、心血管疾病和糖尿病人群[5]。研究[6]表明，绿茶对血管紧张素转换酶(ACE)活性的抑制率比发酵生产的红茶和黑茶要高，可能是多酚类等物质含量和性质发生了变化。目前，葛根提取物已被应用于临床上的冠心病心绞痛、高血压的治疗，其对高盐饮食诱导的小鼠有降压作用[7]，且可改善L-NAME诱导的高血压大鼠心肌肥大和血管内皮细胞肿胀等症状[8]。

研究拟利用冠突散囊菌发酵绿茶与葛根基质，以ACE酶活性的体外抑制率为评价指标，考察基质含水量、葛根添加量和冠突散囊菌孢子悬浮液接种量对ACE抑制活性的影响。同时阐述葛根降血压茶在动物体内的生物利用度，探究将不同剂量的发酵茶液灌胃自发性高血压大鼠(SHR)后对其血压的影响，了解葛根降血压茶在动物体内24 h内发挥的作用，为更好分析可能的降压机制，从其中提取或开发出降血压的新型茶类产品提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 试验材料

葛根、卡托普利：市售；

绿茶：陕西省安康市圣泰生物科技有限责任公司；

冠突散囊菌：从湖南省益阳茶厂伏砖茶中分离，保存于西北农林科技大学健康食品制造与安全实验室；

兔肺ACE、马尿酰—组氨酰—亮酸(HHL，≥98%)、马尿酸(Hip，98%)：西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司；

冰乙酸(≥99.9%)、甲醇(≥99.9%)：色谱级，西安化学试剂厂；

硼酸、氯化钠、浓盐酸(36%)：分析纯，西安化学试剂厂。

1.1.2 试验动物

体重220～240 g，11周龄， 30只SPF级雄性自发性高血压大鼠(SHR)， 6只雄性Wistar-Kyoto(WKY)大鼠，包括饲料和垫料，饲养于西北农林科技大学健康食品制造与安全实验室，购买于北京维通利华实验动物技术有限公司。

1.2 主要仪器

高效液相色谱仪：LC-2030型，马来西亚岛津公司；

恒温恒湿培养箱：MP160B型，上海福玛实验设备有限公司；

恒温水浴锅：HH-ZK2型，巩义市予华仪器有限责任公司；

旋转蒸发仪：YRE-501型，郑州长城科工贸有限公司；

高速冷冻离心机：HC-3018R型，安徽中科中佳科学仪器有限公司；

超纯水机：ULPHW-Ⅱ型，四川优普超纯科技有限公司；

红外水分测定仪：MA35M-1CN型，上海赛多利斯贸易有限公司；

智能无创血压计：CODA-MNTR型，北京世联博研科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 冠突散囊菌孢子悬浮液的制备

(1) PDA培养基活化冠突散囊菌：称取去皮的马铃薯 200 g，琼脂20 g和葡萄糖20 g，量取1 000 mL蒸馏水。将新鲜购买的马铃薯去皮清洗干净，并切成大小均一的块状放入合适的锅中，将量好的蒸馏水倒入锅中并在一定温度下煮沸 20 min。凉至室温后用8层纱布过滤，在滤液中加入称好的葡萄糖和琼脂，加热溶解，并定容至1 000 mL，121 ℃高压蒸汽灭菌15 min。

(2) 孢子悬浮液制备：将保藏在斜面上的分离纯化的菌株接种至PDA培养基上，28 ℃恒温恒湿培养箱培养5 d，无菌操作条件下，挑取菌丝转接到新鲜的PDA培养基上进行活化，28 ℃恒温恒湿培养箱培养5 d。无菌操作条件下，在PDA培养基上加入5 mL无菌生理盐水，涂抹后全部倒入100 mL无菌生理盐水进行稀释，用血球计数板进行计数(0.5～2×105个/mL)，备用。

1.3.2 不同发酵程度的葛根茶制备 称取20 g绿茶于灭菌锅汽蒸，加入3 g葛根粉(葛根打碎，过60目筛)，采用超纯水调整发酵基质含水量为25%，121 ℃灭菌锅汽蒸15 min，冷却后接种3%的冠突散囊菌孢子悬浮液，于28 ℃、78%湿度下分别培养5，7，9，11，13 d，取出后自然干燥5 h后备用。

1.3.3 单因素试验

(1) 葛根添加量：按1.3.2进行发酵，发酵时间7 d，分别考察葛根添加量(1，2，3，4，5 g)对发酵茶ACE活性抑制率的影响。

(2) 基质含水量：按1.3.2进行发酵，发酵时间7 d，分别考察基质含水量(15%，20%，25%，30%，35%)对发酵茶ACE活性抑制率的影响。

(3) 孢子悬浮液接种量：按1.3.2进行发酵，发酵时间7 d，分别考察孢子悬浮液接种量(1%，2%，3%，4%，5%)对发酵茶ACE活性抑制率的影响。

1.3.4 正交优化试验 结合单因素条件优化试验结果，选取葛根添加量、含水量和孢子悬浮液接种量3个因素，设计L9(34)正交优化试验，分析其对ACE酶活性体外抑制率的影响。

1.3.5 ACE活性抑制率测定

(1) 样品提取：将发酵茶粉碎，过60目筛。以无水乙醇为提取媒介，按料液比1∶10 (g/mL)，常温超声(100 W，20 kHz)提取30 min，提取两次，用旋转蒸发仪将提取液减压浓缩，得到乙醇浸膏，再将其溶于10 mL SSB(pH 8.3)，即得100 mg/mL的发酵茶提取物，4 ℃贮藏备用。

(2) 马尿酸标准曲线的建立：取浓度为1.00 mmo/L的马尿酸标样，用超纯水分别稀释成0.01，0.05，0.10，0.50，1.00 mmo/L系列浓度，在最佳流动相和波长下用HPLC测定Hip的峰面积，Hip峰面积与浓度的线性关系为y=1 756.35x+101.56，R2=0.999 5。

(3) ACE活性抑制率测定：通过HPLC检测马尿酸峰面积来计算抑制ACE活性水平，并按式(1)计算ACE酶活性的体外抑制率。

R=(CA-CS)/(CA-C0)×100%，

(1)

式中：

R——体外抑制率，%；

CA——对照组马尿酸浓度，mmol/L；

CS——样品组马尿酸浓度，mmol/L；

C0——空白对照组马尿酸浓度，mmol/L。

HPLC检测条件：检测器SPD-M20A，Hypersil ODS C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相A为0.1%冰乙酸水溶液，流动相B为甲醇溶液，流速0.8 mL/min，柱温35 ℃，进样量10 μL，检测波长228 nm。梯度洗脱步骤见表1。

表1 梯度洗脱表Table 1 Gradient elution procedure

1.3.6 试验动物分组及剂量设置 饲养环境(25±1) ℃，相对湿度55%～65%，昼夜明暗交替，自主摄食和饮水，适应性喂养1周后进行灌胃试验。将根据正交试验优化得到的发酵茶打碎成粉，称取6 g，加入100 mL 100 ℃蒸馏水，沸水浴加热30 min，过滤，旋蒸，100 mL蒸馏水复溶，得到60 g/L的茶液提取物。每组大鼠按1 mL/100 g调整灌胃量。试验前，隔天测定大鼠血压，待稳定适应后开始记录试验。自发性高血压大鼠给药前血压在适应性喂养后测量，间隔2 d后再次测量，重复3次取平均值为给药前初始值。试验组分别在给药后的2，4，6，12，24 h测定自发性高血压大鼠的收缩压和舒张压。

将30只SHR随机分为5组(每组6只)：茶高、中、低剂量组、模型对照组和阳性对照组；12只WKY大鼠随机分为2组(每组6只)：正常对照组、茶高剂量灌胃组。茶高剂量组(SHR-H)，600 mg/kg葛根降血压茶液；茶中剂量组(SHR-M)，300 mg/kg葛根降血压茶液；茶低剂量组(SHR-L)，150 mg/kg葛根降血压茶液；模型对照组(SHR-NaCl)，相应剂量生理盐水；阳性对照组(SHR-卡托普利)，卡托普利，根据人日用量通过体表面积换算得到剂量为1 mg/kg；正常高剂量组(WKY-H)，高剂量葛根降血压茶液；正常对照组(WKY)，相应剂量生理盐水。

1.3.7 数据处理 所有试验重复3次取平均值，结果以均数±标准差表示，显著性检验为T检验(P<0.05)，采用SPSS 20.0软件进行统计处理，Excel 2016软件作图。

2 结果与分析

2.1 发酵时间对ACE酶活性体外抑制率的影响

由图1可知，整个发酵过程中，除发酵第9天的茶样抑制率显著降低外，其他发酵茶的ACE酶活性抑制率均高于未发酵的绿茶，且发酵第7天和第13天的抑制率较高，分别为74.68%和76.03%。第7天的发酵茶被赋予独特的“金花菌”香，有丰富醇香的气味且苦涩程度降低，与龚受基等[9]的结果类似。发酵同时还掩盖了葛根的中药味道和气味，与张波等[10]的结论类似。发酵第13天的发酵茶存在明显霉味，感官品质上逊色于第7天的回甘茶香，可能是由于绿茶基质中酚类及氨基酸类物质被生物转化，且醇类化合物是发酵茶中产生花香和木香气味的挥发性物质[11]。故选取第7天为发酵终止时间。

图1 发酵过程中ACE酶活性的体外抑制率变化Figure 1 Changes in ACE-inhibitory rate during fermentation

2.2 各因素对葛根降压茶ACE抑制率的影响

2.2.1 葛根添加量 由图2可知，当葛根添加量为1 g时，ACE酶活性体外抑制率最高(75.43%)，当葛根添加量继续增大时，ACE酶活性抑制率呈下降趋势。当葛根添加量超过3 g时，发酵茶的ACE酶活性抑制率低于原始绿茶原料(70.11%)。在发酵基质中加入葛根是因为其活性物质，如葛根素可通过RAAS系统影响自发性高血压大鼠的血压，而ACE是经典RAAS过度激活的途径之一[12]。发酵过程中，冠突散囊菌的代谢和生物转化可使茶多酚类物质含量有不同程度的下降[9]，也可将葛根中的糖苷型异黄酮转化为苷元型异黄酮[13]。ACE酶活性体外抑制率随葛根添加量的增大而下降，可能是因为发酵基质中绿茶基质比例降低，或具降压潜力的活性物质的成分和含量比例变化，不利于抑制ACE活性。研究[14]表明，葛根降血压茶中大豆苷和染料木苷的含量与发酵过程中冠突散囊菌孢子数量、微生物酶活(多酚氧化酶等)和ACE抑制率呈反比，即葛根的添加，不利于发酵茶的降压功效改善。故选择葛根添加量为1～3 g。

图2 葛根添加量对ACE抑制活性的影响Figure 2 Effects of pueraria addition on ACE- inhibitory rate

2.2.2 基质含水量 由图3可知，从ACE酶活性体外抑制率来看，基质的最适含水量为20%～30%。ACE酶活性体外抑制率随基质含水量的进一步增加而下降，且最优含水量明显低于文献[15]。这可能是因为微生物菌株的呼吸模式及生长代谢促使分泌的降解酶(如蛋白酶)适合的含水量不同[16]，致使代谢产物的生成受到影响，从而影响ACE酶活性抑制率。因此，通过对发酵基质含水量的控制，可以获得较高的ACE酶活性抑制率。

图3 基质含水量对ACE抑制活性的影响Figure 3 Effects of water content on ACE-inhibitory rate

2.2.3 孢子悬浮液接种量 由图4可知，冠突散囊菌接种量与ACE酶活性体外抑制率呈正比，当孢子悬浮液接种量为5%时，ACE活性抑制率最高，表明冠突散囊菌决定了发酵成品中具有抑制ACE酶活的生物活性物质生成。有研究表明，在适当接种量范围内，冠突散囊菌菌株大量生长繁殖，微生物降解酶如纤维素酶、多酚氧化酶活性会明显增加[2]，释放多种生物活性代谢物如类黄酮、茶多酚衍生物、生物碱等[17]，从而非竞争性抑制ACE活性。冠突散囊菌在发酵过程中分泌了多种酶，如多酚氧化酶、α-淀粉酶等，使基质中活性物质(茶多酚、生物碱等)含量发生变化，最终影响发酵茶的ACE抑制率[14]，说明选择较大的接种量可以有效缩短发酵周期，且采用冠突散囊菌固态发酵是一种有效的创新工艺思路。故选择孢子悬浮液接种量为3%～5%。

图4 孢子悬浮液接种量对ACE抑制活性的影响Figure 4 Effects of spore suspension volume on ACE-inhibitory rate

2.3 正交优化试验

以单因素试验为基础，对葛根添加量、基质含水量和孢子悬浮液接种量进行正交优化设计以确定制备葛根降压茶的最优发酵条件。正交试验因素水平见表2，试验设计及结果见表3。

表2 正交试验因素水平表Table 2 Orthogonal test design

由表3可知，各因素对ACE酶活性抑制率影响大小依次为A>C>B，即葛根添加量对抑制ACE酶活性影响最大，孢子悬浮液接种量次之，基质含水量对发酵茶的ACE抑制率影响最小。发酵茶的最优条件为A2B1C3，即葛根添加量2 g、基质含水量20%、孢子悬浮液接种量5%，此条件下测得ACE酶活性抑制率平均值为76.13%(n=3)，且得到的葛根降压茶气味醇香、滋味回甘。发酵结束后高效液相色谱定量分析结果表明，茶多酚、生物碱等活性物质含量发生了不同程度的变化，同时ACE酶活性抑制率也显著提高。

表3 正交试验设计及结果Table 3 Orthogonal test design and results

2.4 给药对自发性高血压大鼠尾动脉收缩压的影响

由表4可知，给药4 h后，SHR-卡托普利组相较SHR-NaCl组最高降低了(2.81±0.57) kPa；与给药前相比，灌胃卡托普利后SHR收缩压降低了(2.48±0.44) kPa。SHR-H组在灌胃6 h后达到收缩压的最低值，与SHR-NaCl组相比降低了(2.42±0.22) kPa，与给药前相比降低了(2.14±0.56) kPa。与SHR-H组不同的是，SHR-M组在灌胃2 h后出现血压升高的现象，随后与SHR-H组相似，在灌胃6 h后达到最低收缩压，比对照组降低了(1.20±0.27) kPa，且在6 h时相较SHR-M的给药前降低了(1.28±0.27) kPa。SHR-M组整体降压效果较SHR-H组弱，灌胃24 h后收缩压也回升至给药前的初始血压。SHR-L组大鼠状态较其他灌胃组躁动，表现为好斗。SHR-L组的收缩压在灌胃4 h后开始降低明显，并在12 h达到最大降压效果，较SHR-NaCl组降低了(1.17±0.62) kPa，与给药前相比在灌胃6 h时降低了(1.24±0.14) kPa，降压效果与SHR-M组相似。说明灌胃卡托普利后降压作用可维持18～20 h，SHR-H组可维持6～12 h，SHR-M组可维持6 h，而SHR-L组可维持约8 h。随着葛根降血压茶灌胃浓度的增加，SHR大鼠的收缩压降低幅度也随之变大，说明降压效果与葛根降血压茶的浓度有一定相关性，与邬秀宏等[18]的研究结果相似。综上，灌胃葛根降血压茶对SHR大鼠具有显著的降压作用，且发酵茶的浓度越高，降压作用越明显。

发酵茶之所以可以对SHR起到急性降压作用，是因其活性物质经微生物酶分解后生成的代谢产物作用于自发性高血压大鼠体内的高血压发病机制。ECG、大豆苷、染料木素、EC和大豆苷元是葛根降血压茶中抑制ACE酶活性最相关的物质，且添加葛根有利于增加发酵茶对ACE酶活性的体外抑制率[14]，这有利于发酵茶改善肾素—血管紧张素—醛固酮系统(RAAS)调节。此外，罗显扬等[19]发现“高原明殊”绿茶显著降低了SHR大鼠的血浆Ang Ⅱ含量而发挥降压功效。李汝月等[20]发现霉茶蛋白有一定降压作用，可改善SHR肾脏组织炎性病灶，并可不同程度地降低TNF-α和TLR4等炎性因子的表达水平，从而对SHR不仅起到降压作用，还对肾脏有保护作用。蒋荣华等[21]也发现广西甜茶多酚能够提高SHR血清中谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)和一氧化氮(NO)活性，改善左心室肥厚，最终明显降低SHR的SBP和舒张压(DBP)。另外，周尧等[22]检测超微绿茶粉在体外消化的活性物质释放量后发现，减少的黄酮类释放量和增加的儿茶素类物质释放有利于促进茶在体内的生物利用率。值得注意的是，葛根降血压茶对SHR 在24 h后的急性降压作用不再显著，说明需长期服用。

2.5 给药对自发性高血压大鼠尾动脉收缩压的影响

由表5可知，与SHR-NaCl组收缩压相比，SHR-卡托普利组在灌胃12 h时降低了(1.94±0.15) kPa，SHR-H组在灌胃6 h时降低了(0.88±0.40) kPa，SHR-M组在灌胃6 h时降低了(0.66±0.40) kPa，并保持到12 h，SHR-L组的降舒张压作用较弱，但在灌胃6 h也降低了(0.49±0.63) kPa。与阳性对照组相比，SHR-H组和SHR-L组在灌胃12 h的舒张压显著高于SHR-卡托普利组。与给药前相比，SHR-卡托普利组显著降低了SHR舒张压，效果为4组给药组中最显著的，SHR-H组在灌胃4 h时下降显著，SHR-M组在灌胃6 h时有明显降压作用，而SHR-L组在灌胃24 h时对SHR的舒张压降压效果不明显。说明葛根降血压茶对自发性高血压大鼠的舒张压作用也依赖于灌胃浓度，浓度越高，舒张压的下降效果越明显，而卡托普利对SHR舒张压的改善作用优于葛根降血压茶。

由表4、表5可知，与给药前相比，t检验分析表明WKY-H在灌胃24 h内舒张压和收缩压均无显著变化，即使是高剂量的灌胃，虽然有波动趋势但最终基本维持在正常的舒张压和收缩压水平，说明葛根降血压茶对正常大鼠的血压影响不大。

表4 各试验组对自发性高血压大鼠尾动脉收缩压的影响†Table 4 Effects on systolic blood pressure of spontaneously hypertensive rats (n=6)

表5 各试验组对自发性高血压大鼠尾动脉舒张压的影响†Table 5 Effects on diastolic blood pressure of spontaneously hypertensive rats (n=6)

3 结论

试验表明，在20 g绿茶基质的基础上，添加2 g葛根、控制20%基质含水量、接种5%冠突散囊菌，发酵7 d后得到的最优发酵茶的血管紧张素转换酶抑制率为76.13%。不同剂量的葛根降血压茶对自发性高血压大鼠在灌胃24 h内均有降低收缩压和舒张压作用，其中300～600 mg/kg的大鼠日用剂量的急性降压效果最显著，且发酵茶对正常血压大鼠无明显降压作用，故初步推测不会影响正常人群的血压。为了达到长期降压功效，需长期饮用发酵茶。然而，食物来源的血管紧张素转换酶抑制性生物活性成分在消化和吸收过程中可能会发生结构转化，进一步降低其生物利用率和生物活性。所以以提高血管紧张素转换酶生物利用率为目的或许可以开发出新型降压产品。