二黄益肾汤调控TGF-β1/Smad 信号通路治疗慢性肾功能衰竭研究*

董彬，于斌，孙闵，刘志华，王乐荣，王祥生

（1.济宁市中医院，济宁 272004；2.济宁医学院中西医结合学院，济宁 272067）

慢性肾功能衰竭（CRF）作为不可逆性疾病，呈慢性进展，最终发展为终末期肾病，需肾脏替代治疗，临床治疗颇为棘手。其主要表现为全身代谢功能紊乱、多系统衰竭，预后一般较差。一般认为，本病的发病与肾间质纤维化密切相关，是导致肾脏结构和功能障碍的主要原因。中国CRF 患者数量高达1.2 亿，造成严重的经济与社会负担。本病的主要病因与外感、内伤有关，病机以本虚标实、标本兼夹为主，本虚表现为气血阴阳的不足，标实主要以湿热瘀毒痰为主，病变部位在肾，涉及脾、胃、心、肝、肺及三焦、膀胱等，以脾肾亏虚为主[1]。随着中医药治疗慢性病优势的凸显，中医药不仅能够改善CRF 患者的临床症状及相关检测指标，延缓CRF 的快速进展，更能改善患者远期病死率，提升远期存活率。

二黄益肾汤主要由黄芪、淫羊藿、大黄、白术、白花蛇舌草、六月雪、莪术、石韦、丹参、砂仁等药物组成，具有补肾健脾、活血通络、清热泄浊之功效，可降低内生肌酐（Scr）和尿素氮（BUN）水平，是济宁市中医院用于气虚湿瘀型CRF 患者治疗的协定处方[2-3]。转化生长因子（TGF）-β1 是TGF 家族成员，是较强的促纤维化因子，Smad 是TGF-β 家族的信号传导分子，TGF-β1 活化后与Smad3 相互识别，TGF-β1/Smad 信号通路在组织纤维化的形成过程中发挥重要作用[4]。然而对于二黄益肾汤治疗CRF肾纤维化的机制与TGF-β1/Smad 信号通路的相关性研究较少，本项目通过5/6 肾切除建立CRF 动物模型，并采用二黄益肾汤进行治疗，分析其对TGFβ1/Smad 信号通路的影响，试阐述其作用机制。

1 材料与方法

1.1 主要实验试剂和仪器 尿毒清颗粒（广州康臣药业有限公司生产），规格为5 g/袋。TGF-β1、Smad3、Smad4、Smad7 购自Abcam 公司，引物购自上海生物工程公司，实时定量-聚合酶链反应（RT-PCR）试剂盒购自天根生化科技有限公司。5424 型小型高速离心机（德国Eppendorf 公司），BioRad CFX96 荧光定量聚合酶链反应（PCR）检测系统（美国BioRad公司）。

1.2 实验动物 SPF 级SD 大鼠40 只（实验动物许可证号：SCXK 鲁20140007），购自山东朋悦实验动物中心。

1.3 动物模型建立及筛选 选取10 只大鼠作为正常组，不进行干预。其余30 只大鼠参考文献方法[5-6]，采用5/6 肾切除方法建立CRF 动物模型。术前常规消毒，2%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠，在左侧肋弓下0.5 cm、脊柱向左旁开1 cm 处切开一垂直于脊柱、长约2.5 cm 的切口。暴露左侧肾脏，结扎左侧肾动脉的2/3 分支后缝合，7 d 后予同法摘除右侧肾脏。术后4 周眼眶后静脉丛采血，进行血清BUN、Scr测定，以BUN、Scr 数值大于健康大鼠2 倍确立模型建立成功。后将模型动物依据Scr 数值随机分为模型组、二黄益肾汤组及尿毒清组，每组10 只。

1.4 干预方案 模型筛选后进行药物干预，根据人与大鼠体表面积换算公式计算，二黄益肾汤临床等效剂量为18.93 g/kg，尿毒清临床等效剂量为2.25 g/kg。二黄益肾汤组成：黄芪15 g，大黄10 g，炒白术15 g，白花蛇舌草20 g，淫羊藿15 g，六月雪30 g，莪术15 g，石韦40 g，丹参40 g，砂仁12 g，药材购自济宁市中医院药房。干预方式为灌胃治疗，干预时间为12 周。

1.5 检测指标

1.5.1 血清Scr、BUN 水平检测 实验结束后，采用戊巴比妥钠进行动物麻醉，腹主动脉采血，全自动生化分析仪检测血清Scr、BUN 水平。

1.5.2 病理学检测 肾组织经4%多聚甲醛固定，梯度乙醇脱水、二甲苯透明处理、石蜡包埋、切片（厚度为4～5 μm）后常规苏木精-伊红（HE）染色，OLMPUS 显微镜观察各组肾组织病理变化并拍照。

1.5.3 肾脏组织TGF-β1、Smad3、Smad4 和Smad7 mRNA 表达量检测 肾脏组织经TRIzol 提取总RNA 后，进行反转录，之后进行RT-PCR 检测。检测指标为TGF-β1、Smad3、Smad4 和Smad7。β-actin为内参，用2-ΔΔCt法计算各基因的相对表达量。引物序列见表1。

表1 RT-PCR 引物序列

1.5.4 肾脏组织TGF-β1、Smad3、Smad4 和Smad7蛋白表达量检测 组织经裂解后进行蛋白提取和定量，之后进行SDS-PAGE 电泳，抗体孵育及发光显色后，进行应用凝胶成像系统扫描，采用Image J图像分析软件进行灰度值分析，TGF-β1、Smad3、Smad4 和Smad7 蛋白相对表达量以目的蛋白与内参β-actin 的灰度值的比值表示。

1.6 统计学处理 应用SPSS 22.0 软件包进行统计学分析。计量资料用均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD 法；计数资料以百分比或率表示，组间比较采用卡方检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 模型动物筛选及一般情况观察 模型建立4 周后，分析BUN 和Scr 水平。结果显示，模型组BUN、Scr 水平与正常组相比呈现增高趋势，差异具有统计学意义（P＜0.01），说明CRF 肾纤维化动物模型建立成功，见表2。正常组大鼠精神状态、生长速度、进食和排便均正常，反应灵敏。模型组动物精神状态萎靡，增长较慢，体毛稀疏，饮水量增加，体质量减轻，被毛无光泽，活动减少，应激反应较差。

表2 正常组与模型组大鼠BUN、Scr 含量检测（±s）

表2 正常组与模型组大鼠BUN、Scr 含量检测（±s）

注：与正常组比较，*P＜0.01。

组别动物数Scr（μmol/L）BUN（mmol/L）正常组型动物1024.20±2.105.46±0.24模3073.80±3.19*14.15±2.39*

2.2 二黄益肾汤对模型动物肾脏组织病理影响 正常组大鼠肾组织染色均匀，肾小管大小、形态正常，肾间质未见明显病理改变。模型组大鼠表现出广泛的肾结构损伤和形态改变，肾小管上皮萎缩，肾小管管腔扩张，间质炎性细胞浸润和肾小管坏死。二黄益肾汤组和尿毒清组肾间质内有少量炎性细胞浸润及纤维组织增生，肾小管扩张程度较轻，肾小囊扩张，但纤维化的面积较模型组小，仍保留部分正常肾小管结构。病理结果显示，二黄益肾汤和尿毒清治疗后能够改善CRF 肾纤维化病变程度。见图1。

图1 各组大鼠HE 染色结果（×200）

2.3 二黄益肾汤对肾功能BUN、Scr 的影响 结果显示，模型组大鼠BUN、Scr 含量高于正常组，差异具有统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，二黄益肾汤组和尿毒清组BUN、Scr 含量呈现降低趋势，差异具有统计学意义（P＜0.01）。二黄益肾汤组BUN、Scr降低趋势较尿毒清组明显。见表3。

表3 各组大鼠BUN、Scr 含量（±s）

表3 各组大鼠BUN、Scr 含量（±s）

注：与正常组比较，*P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.01。

组别动物数Scr（μmol/L）BUN（mmol/L）正常组1024.20±2.105.04±0.31模型组1064.60±2.27*13.22±1.21*尿毒清组1044.00±2.98#7.76±0.55#二黄益肾汤组1038.50±2.95#6.70±0.48#

2.4 二黄益肾汤对肾脏组织TGF-β1/Smad 信号通路mRNA 的影响 RT-PCR 结果显示，与正常组相比，模型组TGF-β1、Smad3 和Smad4 mRNA 表达升高，Smad7 mRNA 表达降低，各指标差异具有统计学意义（P＜0.05）。与模型组相比，二黄益肾汤组和尿毒清组TGF-β1、Smad3、Smad4 mRNA 的表达量呈现降低趋势，而Smad7 mRNA 的表达量呈现升高趋势，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见表4。

表4 各组TGF-β1、Smad3、Smad4 和Smad7 mRNA表达量（±s）

表4 各组TGF-β1、Smad3、Smad4 和Smad7 mRNA表达量（±s）

注：与正常组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。

组别动物数 TGF-β1Smad3Smad4Smad7正常组101.001.001.001.00模型组103.07±0.03** 2.75±0.06** 2.05±0.19** 0.82±0.20*尿毒清组101.78±0.04## 2.24±0.08# 1.48±0.22## 1.22±0.16##二黄益肾汤组100.78±0.10## 2.10±0.08## 1.43±0.12## 1.04±0.13#

2.5 二黄益肾汤对肾脏组织TGF-β1/Smad 信号通路蛋白的影响 Western Blot 检测结果显示，与正常组相比，模型组TGF-β1、Smad3 和Smad4 的蛋白表达量升高，而Smad7 的蛋白表达量降低，差异具有统计学意义（P＜0.05）。与模型组相比，二黄益肾汤组和尿毒清组TGF-β1、Smad3、Smad4 的蛋白表达量降低，而Smad7 蛋白的表达水平升高，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见图2。

图2 TGF-β1、Smad3、Smad4 和Smad7 的蛋白表达量（±s，n=10）

3 讨论

CRF 属于中医“关格”“癃闭”“虚劳”等范畴，多为其他慢性疾病或并发症迁延不愈发展而来，常见于水肿、淋证、消渴、尿血、眩晕等疾病后期。其基本病机为脾肾亏虚，湿浊内蕴，病变部位主要在脾、肾，并与肠相关。本病的发病主要与湿、浊、瘀、毒相关，是病情演变及加重的主要因素，且贯穿于本病的始终。因而一些医家主张补脾益肾治其本，化湿泄浊治其标[7]。

二黄益肾汤方中黄芪、淫羊藿为君药，主要用于补肾健脾、利水消肿，针对脾肾亏虚起到补养作用。砂仁化湿行气，白术益气健脾、燥湿利水，兼助黄芪补气，两药针对湿浊起到化湿泄浊的效果。莪术破血行气消积，丹参活血祛瘀止痛，两药主要用于活血化瘀通络，合用针对湿、浊、瘀、毒起到治疗效果，共为臣药。大黄通腑泄浊，配伍丹参又可活血逐瘀；白花蛇舌草清热利湿解毒；六月雪清热利湿、舒筋活络，加用石韦共助湿浊从小便而解，上述4 味共为佐药，使邪有出路。大黄兼为使药，引药入血络，使久病顽疾邪去正安。全方共奏补肾健脾、利湿泄浊、活血化瘀之效，标本兼治。

CRF 的发病主要与自身免疫反应、感染、药物应用、遗传因素、环境和饮食因素等相关，并与肾小管间质和肾小球纤维化有关[8]。研究发现，TGF-β1是参与肾间质纤维化的主要细胞因子，而Smads 信号通路是TGF-β1 促纤维化的中心调控环节，TGFβ1 可刺激纤维细胞增殖并促使其产生胶原蛋白，抑制细胞外基质降解，Smads 是TGF-β1 的下游调控因子。TGF-β1 与细胞膜上的受体结合后，激活细胞内Smad2、Smad3 并促使其磷酸化活化，促进TGF-β1信号转入细胞核，发挥其促纤维化作用。Smad6 可以抑制Smads，并阻断TGF-β1 信号转导[5]。

黄芪是治疗CRF 的常用有效中药之一，研究表明黄芪通过抑制TGF-β1 信号通路的激活对CRF具有一定的抗纤维化和抗炎作用，并且能够降低BUN、Scr 水平[9]，与本研究结果一致。研究发现淫羊藿可以降低CRF 患者可溶性白细胞介素（IL）-2 受体、IL-6 和干扰素-α（IFN-α）含量，并且淫羊藿单体能够抑制活化的成纤维细胞和系膜细胞增殖以及TGF-β1 表达，从而发挥防治肾纤维化作用[10]。研究认为砂仁的乙酸乙酯层提取物具有较强的抗氧化作用，砂仁多糖具有很强的清除自由基的活性作用，可能与其抗纤维化机制相关[11]。白术内酯Ⅰ和白术内酯Ⅲ具有明显的促进促炎性巨噬细胞因子的表达作用，具有一定的抗炎活性，另有研究证实，白术具有一定的抗氧化能力[12]。Cohly 等[13]研究发现莪术发挥抗氧化作用体现在其中的姜黄素成分能够抑制脂质的过氧化，降解细胞凋亡基因Fas-L、Fas表达并溶解细胞来保护受损的肾细胞[14]。刘迟等[15]检测研究莪术降低单侧输尿管梗阻大鼠肾间质纤维化中TGF-β1、核转录因子-κB（NF-κB）、Ⅳ型胶原等相关纤维化指标的表达。丹参主要成分是丹参酮ⅡA，具有改善微循环、抗纤维化的作用。陆海英等[16]发现丹参酚酸B 抑制肾组织基质金属蛋白酶-2（MMP-2）、基质金属蛋白酶抑制剂-2（TIMP-2）的表达，改善大鼠纤维化水平。另有研究发现丹参能够抑制促炎性细胞因子的释放和氧化应激反应，抑制肾小管间质转化，主要机制与其能够拮抗TGF-β1的纤维化作用相关[17]。大黄酸和大黄素是大黄的主要活性成分，研究发现大黄酸能够抑制肾间质纤维化，改善肾脏微循环，大黄素可以抑制肾小球纤维化，大黄提取物能够抑制TGF-β1/Smad3 的信号活化，增加Smad7 含量，从而通过调控TGF-β/Smad 信号通路发挥抗纤维化作用[18]。另有研究证实大黄酸可以抑制TGF-β1、结缔组织生长因子（CTGF）的基因表达，从基因水平抑制细胞外基质（ECM）积聚[5]。研究证实，白花蛇舌草的水提液具有肾脏保护作用，能够降低肾脏肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、IL-6 和IL-10等炎性因子的表达，白花蛇舌草具有较好的抗纤维化作用，网络药理学研究发现其作用机制可能与TGF-β 信号通路、肾细胞癌信号通路和Janus 激酶信号转导与转录激活因子（JAK-STAT）信号通路相关[19]。六月雪系茜草科白马骨属植物，临床常用于治疗肾脏疾病，大量应用可以降低蛋白尿与BUN、Scr含量，作用机制可能与其能够降低氧化应激反应、抑制肾间质纤维化相关[20]。石韦具有较好的抗炎利尿及抗氧化作用[21]。

本研究采用5/6 肾切除方法建立CRF 肾纤维化动物模型，病理结果显示CRF 肾纤维化存在炎性细胞浸润、肾小球萎缩、肾间质增宽的情况，生化检测显示Scr 和BUN 呈现升高趋势，结合其他文献的研究结果，能够确定CRF 动物模型建立成功。中医药干预治疗能够改善模型动物CRF 肾纤维化的病理结构，减轻炎性细胞浸润和纤维组织增生情况，降低Scr 和BUN 含量。

通过RT-PCR 和Western Blot 分析TGF-β1/Smad 通路相关指标的含量变化，结果显示CRF 的发病与TGF-β1、Smad3 和Smad4 的激活以及Smad7 基因、蛋白含量的下调相关。二黄益肾汤能够抑制TGF-β1、Smad3 和Smad4 的激活，进而提高Smad7 含量，通过调控TGF-β1/Smad 信号通路发挥相关的治疗作用。

综上所述，二黄益肾汤能够保护肾脏，抑制肾脏纤维化进程，作用机制与其对TGF-β1/Smad 信号通路的调控相关，进而为健脾补肾、化湿泄浊法治疗CRF 提供基础研究支持。