以燕麦β-葡聚糖为主的酵母冻干保护剂优化

李真，姬生鑫，梁静静，索标，范会平，艾志录*

（1.河南农业大学食品科学技术学院，河南郑州 450002）

（2.农业农村部大宗粮食加工重点实验室，河南郑州 450002）

酿酒酵母是与人类关系最为密切一种酵母，酿酒酵母菌体中含有多种营养物质成分，是良好的膳食补充剂，这些营养成分经过不断的研究开发可以应用于食品、医药、饲料、化妆品等领域[1]。但其在食品制造中最主要的应用还是发酵，如酿酒工业[2]、奶制品行业[3]、调味品[4]以及发酵面食加工领域[5]等。与湿酵母相比，活性干酵母具有含水量低、复水快、性能稳定、易于运输和使用方便等优点。

目前，常用的酵母干燥保藏方法主要有：真空冷冻干燥、流化床干燥、喷雾干燥，相对于流化床干燥和喷雾干燥，真空冷冻干燥技术酵母的存活率较高，对于热较为敏感的酵母菌有更大的优势，受到大家的青睐。但在实际干燥过程中依然会不可避免的出现细胞不可逆损伤，细胞死亡活力下降等问题。因此需要采取相应的保护措施，其中冻干保护剂是比较常用的提高菌剂冻干存活率和稳定性的有效方法，目前常用的保护剂主要有脱脂奶粉、山梨醇、甘油[6]、海藻糖、谷氨酸钠[7]、蔗糖、乳糖、抗坏血酸、菊粉、甘露醇[8]等。宋志远[9]研究得出以脱脂乳粉5%、甘露醇4%、抗坏血酸3%比例作为果蔬生防酵母细胞的复合冻干保护剂，酵母细胞存活率可以达到83.64%。周秋阳等[10]研究发现以海藻糖12.45 g/100 mL、谷氨酸钠13.56 g/100 mL、山梨醇5.43 g/100 mL 作为酵母复合冻干保护剂时，酵母细胞冻干存活率达84.21%。王华等[11]采用聚乙二醇1.10 g/100 mL、L-谷氨酸钠7.07 g/100 mL、蔗糖14.15 g/100 mL 作为热带假丝酵母菌复合冻干保护剂时，冻干存活率为82.73%。Han[12]研究表明以脱脂奶粉1.5%、聚乙二醇0.1875%、海藻糖5.25%配比的复合低温保护剂，冻干海洋酵母Sporidiobolus pararoseusZMY-1 的存活率为93.9%。Zhang[13]研究表明以海藻糖20%、谷氨酸钠2%、5%聚乙烯吡咯烷酮和20%脱脂牛奶配比的复合低温保护剂，冻干毕赤酵母的存活率为79.4%。蔡孟轩等[14]优化了橄榄假丝酵母的保护剂配方，最终配方为海藻糖、脱脂乳粉、谷氨酸钠按15%、10%、2%的比例混合，所得酵母存活率为69.7%。然而，迄今为止国内外将β-葡聚糖作为冻干保护剂的研究较少，以燕麦β-葡聚糖为主，与γ-聚谷氨酸和甘露醇复合作为酵母冻干保护剂的研究更是未见报道。燕麦β-葡聚糖和γ-聚谷氨酸为不能自由通过细胞膜的大分子非渗透型保护剂。

不同类型保护剂的作用机制差异较大，复配使用不同类型保护剂相互协调更能效减小微生物在冷冻过程中的死亡率。燕麦β-葡聚糖和γ-聚谷氨酸为不能自由通过细胞膜的大分子非渗透型保护剂；甘露醇是可以自由通过细胞膜的小分子渗透型保护剂，并且也可以在水中形成无定型结构来维持蛋白的稳定性，阻止细胞膜蛋白的聚集，保护细胞膜骨架不受损害。因此，为进一步提高酿酒酵母在冷冻及干燥等各种不利环境下的存活率。本研究以燕麦β-葡聚糖、γ-聚谷氨酸、甘露醇为冻干保护剂，并利用中心复合试验设计（CCD）优化得出酵母存活率最高时冷冻干燥保护剂最佳添加比，为后期酿酒酵母的应用奠定基础，也为新型酵母冻干保护剂的开发与应用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验菌种及培养基

本试验所使用的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）从安琪高活性酵母中分离得到；YPD 培养基：葡萄糖2.0%、胰蛋白胨2.0%、酵母浸粉1%，121℃灭菌20 min。

1.1.2 主要试剂

燕麦β-葡聚糖（纯度80%）由张家口一康生物科技有限公司提供；胰蛋白胨、酵母浸粉购于赛默飞世尔科技有限公司；γ-聚谷氨酸购于西安四季生物科技有限公司；甘露醇购于浙江一诺生物科技有限公司。燕麦β-葡聚糖、γ-聚谷氨酸、甘露醇为食品级，其他试剂均为分析纯。

1.1.3 主要仪器与设备

5430R 型离心机，eppendorf 有限公司；SX-500型高压蒸汽灭菌锅，日本Tomy Digital Biology；BPMJ-150F 型培养箱，上海一恒科学仪器有限公司；BTP.8XL型冷冻干燥机，德祥科技有限公司；SZCL-4A型智能磁力加热搅拌器，巩义市予华仪器有限责任公司；TP614000A 型显微镜，杭州图谱光电科技有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 菌悬液的制备与冷冻干燥

参照邵明倩[15]酵母冻干粉制备方法略作修改，将酵母菌培养到稳定期后，离心速度为6000 r/min，离心5 min，离心温度为20 ℃，无菌水洗涤两次。菌泥与保护剂质量比为1:2，30 ℃恒温箱中平衡60 min，之后于-18 ℃冰箱中预冻8 h，预冻结束后迅速放入真空冷冻干燥机中。冻干工艺：冷阱温度-75 ℃，真空度145～155 mT，冻干时间20 h。

1.2.2 冻干存活率的计算

酵母冻干粉用0.85%的无菌生理盐水复水至冻干前体积，溶解之后放入30 ℃恒温培养箱中活化30 min，利用美兰染色法测定酵母冻干存活率[16]，存活率计算见下式。

1.2.3 单因素轮换试验

选取燕麦β-葡聚糖、γ-聚谷氨酸、甘露醇作为冻干保护剂，首先固定γ-聚谷氨酸、甘露醇添加量为0.167%、1.33%，燕麦β-葡聚糖添加量依次为4%、5%、6%、7%、8%，可以得到最优燕麦β-葡聚糖添加量。固定最优燕麦β-葡聚糖添加量和甘露醇添加量1.33%，γ-聚谷氨酸的添加量依次为0.033%、0.1%、0.167%、0.233%、0.3%，得到最优γ-聚谷氨酸添加量。最后固定最优燕麦β-葡聚糖和γ-聚谷氨酸添加量，甘露醇的添加量依次为0.33%、0.67%、1%、1.33%、1.67%，得到最优甘露醇添加量。上述保护剂的配置均用无菌水在恒温75 ℃磁力搅拌器中溶解均匀，冷却至室温备用。

1.2.4 中心组合设计

根据单因素轮换试验结果得到的燕麦β-葡聚糖、γ-聚谷氨酸、甘露醇三个最优的添加量，将这三个点作为中心组合设计的中心点进行试验设计，以酵母冻干存活率为响应值，确定酿酒酵母冷冻干燥保护剂的最优组合。试验因素水平见表1。

表1 中心优化组合试验变量和水平Table 1 Test variables and levels of the centrally optimized combined design

1.2.5 扫描电镜观察

扫描电镜样品的处理参考张嗣萍等[17]的方法。

1.2.6 数据处理

每组试验均重复3 次，结果用X±SD 表示。试验数据全部采用SPSS 16.0 软件进行显著性检验和单因素方差分析，利用Design-Expert 8.06 软件的Central Composite Design 进行响应面设计与分析。

2 结果与分析

2.1 单因素轮换试验

2.1.1 燕麦β-葡聚糖对酵母冻干存活率的影响

在冷冻干燥过程中，以氢键形式与蛋白质极性基团连接的水分子逐渐被脱去，导致蛋白质结构破坏，功能失调；但是含有多羟基结构的保护剂能够代替水分子的位置，并以“水化膜”的形式包裹蛋白表面，从而维持蛋白结构和功能[18]。由表1 可知，随着燕麦β-葡聚糖添加量的增大，酵母细胞的冻干存活率呈现一个先上升后下降的趋势。当燕麦β-葡聚糖添加量为6%时，酵母细胞存活率达到最大，为80.57%。可能是因为燕麦β-葡聚糖作为大分子化合物能够以“包裹”的方式来保护细胞也可能是大分子化合物在保护细胞的同时还可以促进小分子化合物对细胞作用效果[19]。Crowe 等[20]研究发现糖能够取代细胞膜表面的水分子，从而避免干燥引起的细胞膜的有害相变。Desmond等[21]发现冻干Lactobacillus paracaseiNFBC338 时，在脱脂乳保护剂基础上，另外添加葡聚糖后菌体的贮藏稳定性较单独添加脱脂乳组显著改善。试验过程中，我们发现浓度越高β-葡聚糖（≥7%），冷却时越易形成凝胶，不利于后期操作和酵母的均匀分散，也可能是此原因致使β-葡聚糖浓度过高时酵母活菌数反而降低。

2.1.2γ-聚谷氨酸对酵母冻干存活率的影响

由图2 可知，随着γ-聚谷氨酸添加量的增大，酵母细胞的冻干存活率呈现一个先上升后下降的趋势。当γ-聚谷氨酸添加量为0.13%时，酵母细胞存活率达到最大，为80.57%；之后随着γ-聚谷氨酸的添加量的升高，酵母细胞冻干存活率呈现出一个先下降后趋于平缓的趋势。Bhat[22]通过透射电镜观察得到γ-聚谷氨酸作为冻干保护剂时，可以将细胞包裹起来从而减少细胞受到冷冻干燥的损伤。

2.1.3 甘露醇对酵母冻干存活率的影响

甘露醇不仅可作为优良的骨架剂使用，而且在一些保护剂配方中它能够兼作蛋白质的冻干保护剂[23]。由图3 可知，随着甘露醇添加量的增大，酵母细胞的冻干存活率呈现先显著上升，后显著下降的趋势。当甘露醇添加量为1%时，酵母冻干存活率达到最大，为87.18%，并且随着甘露醇添加量的升高，酵母细胞存活率呈现一个显著下降的趋势。可能是因为甘露醇对蛋白质的保护作用与其浓度、形态结构有关，而浓度与结晶状态有时又有一定的关联性[24]。Izutsu[25]研究表明较低浓度（1%或更低）的甘露醇通过形成无定型结构来保护蛋白质免于聚集，但在更高浓度下，甘露醇通过形成晶体结构来增强蛋白质的聚集。无定型结构的甘露醇会促进蛋白质的稳定，而高浓度的甘露醇形成的晶体结构对于蛋白质没有保护作用，甚至还会促进水分子对细胞的破坏[26]。因此当甘露醇浓度高于1%时酵母细胞存活率呈现一个显著下降的趋势。

2.2 酵母冷冻干燥保护剂的中心响应面优化

2.2.1 响应曲面试验设计及结果

根据单因素试验分析结果，以燕麦β-葡聚糖、γ-聚谷氨酸、甘露醇添加量为因素，由Design-Expert 8.06软件设计3 因素3 水平的20 组响应面优化试验方案，结果见表2。

2.2.2 响应曲面二次回归模型的建立及显著性检验

采用中心响应面法（CCD）研究了燕麦β-葡聚糖、γ-聚谷氨酸、甘露醇水平对冷冻干燥后酵母细胞存活率的影响。这三个自变量的水平见表1。根据表2 可知，共进行了20 次不同组合试验。对试验数据进行多元回归分析，用二次多项式方程表示冻干后酵母细胞的存活率：

表2 Central Composite Design 响应曲面试验设计方案及结果Table 2 Central Composite Design response surface test design scheme and results

式中：

Y——冻干酵母细胞存活率，%；

A——燕麦β-葡聚糖；

B——γ-聚谷氨酸；

C——甘露醇。

为了评估拟合的二次多项式模型的显著性和充分性，由表3 可知，Pmodel＞F 并小于0.0001，说明该模型非常显著，表明建立的模型与试验数据相符。失拟项可以反应所建模型与试验的拟合程度，p=0.4584＞0.05，不显著，说明试验点均能用模型进行描述，且上述拟合的二次回归方程能够很好地预测酵母冻干后的存活率。多项式模型的拟合优度可以通过决定系数R2和相关系数R 来检验。在这种情况下，得到的R2=0.9827 意味着只有1.73%的响应的可变性不能被模型解释。相关系数R=0.9672，表明试验结果与预测结果吻合较好，模型具有较高的意义。

表3 酵母存活率响应曲面二次回归模型方差分析结果Table 3 Results of analysis of variance for yeast survival rate response surface quadratic regression model

2.3 响应面图及等高线图分析

响应面分析法不但能够分析各反应因素对目标值的影响，还能对最佳反应条件进行预测优化。由图4、图5、图6 显示了方程的三维响应面，证实了拟合面有真实的最大值。当其中一种物质的浓度一定时，酵母冻干存活率随着其他两种物质浓度的增加呈现先上升后降低的趋势，说明响应曲面中存在极大值点，即存在保护剂最佳浓度。通过软件计算得到方程的极值点，燕麦β-葡聚糖添加量为6.56%、γ-聚谷氨酸添加量为0.15%、甘露醇添加量为1.15%，此时通过响应面优化模型预测得到平均存活率为89.86%，最大时可达90.69%。

2.4 燕麦β-葡聚糖复合保护剂对菌体形态的影响

利用扫描电镜对冷冻干燥后酵母细胞形态进行研究，由图7a 可知，未添加燕麦β-葡聚糖复合保护剂部分酵母细胞出现较多的褶皱、破裂现象，说明在冷冻和冷冻干燥过程中会损伤酵母细胞。由图7b，在添加燕麦β-葡聚糖复合保护剂后，未发现酵母细胞出现褶皱、破裂的现象，说明燕麦β-葡聚糖复合保护剂的添加可以维持酵母细胞结构不被冷冻和冷冻干燥破坏，并且维持复水过程中酵母细胞结构的稳定性。

3 结论

本研究通过中心优化响应面法优化了以燕麦β-葡聚糖为主的酿酒酵母细胞冷冻干燥保护剂配方，首先通过单因素试验逼近最大响应区域，最后通过中心响应面优化试验拟合出一个三元二次多项式方程，得到最佳配方：燕麦β-葡聚糖6.56%、γ-聚谷氨酸0.15%、甘露醇1.15%，酵母冻干存活率达到最高，为90.69%，与理论预测值酵母存活率89.86%接近。通过对酿酒酵母的冻干保护剂配方的优化，可以为酿酒酵母冻干保护研究提供理论参考，该配方酵母细胞存活率可达90.69%，具有较高的市场应用价值。