天津地区帕金森病患者GRIN2A、GRIN2B基因rs4998386位点多态性观察

肖颖，张本恕

天津医科大学总医院神经内科，天津 300052

目前研究认为，帕金森病（PD）动物模型中N-甲基-D-谷氨酸受体（NMDAR）表达可导致PD症状变化，黑质纹状体网状结构阻断后可减轻PD的运动障碍症状[1]。谷氨酸盐介导的兴奋性神经毒性与PD的退行性变有着密切关联。而这种兴奋性是由NMDAR所调控。NMDAR是谷氨酸门控的离子型谷氨酸盐受体[2]，它几乎参与脑的所有功能[3]。NMDAR谷氨酸位点亚单位活化和因子转换表达，可调节谷氨酸盐释放，在介导PD患者大脑谷氨酸盐的神经传递功能中起一定作用[4]。多项研究结果显示，PD患者多巴胺能神经元的退行性变可能是由NMDAR单核苷酸多态性所致。因此，本研究对PD患者编码NMDAR关键亚基NR2A、NR2B的GRIN2A、GRIN2B基因rs4998386位点多态性进行观察，并分析其与天津地区PD发病的相关性。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择天津医科大学总医院2012年7月—2013年8月神经内科收治的PD患者纳入研究。纳入标准：符合英国PD协会脑库的PD临床诊断标准[5]和2016年我国制定的PD诊断标准[6]，随诊至少1年以上。共104例PD患者进入研究（PD组），男60例、女44例，年龄65～ 80（76.5±5.7）岁，无其他器质性疾病及不良病史。选择同期门诊查体健康者110例纳入对照组，男64例、女46例，年龄65～80岁（74.8±4.6）岁。入选研究对象均为天津地区汉族人群，两组性别、年龄等一般资料差异无统计学意义（P均＞0.05）。本研究经天津医科大学总医院伦理委员会批准（2012-6），所有研究对象对本研究知情同意并签署基因检测同意书。

1.2 GRIN基因rs4998386位点多态性检测方法

1.2.1 DNA的提取 取两组EDTA抗凝静脉血2 mL，用TKM法提取基因组DNA。

1.2.2 GRIN2A基因rs4998386位点T/C多态性观察 上游引物序列为5'-CTCTGCCATGCAAAACACAC-3'、下游引物序列为5'-TGGAAATCCAGTTGAATAACATT-3'。反应条件为94℃ 5 min；94℃58 s、60 ℃ 45 s、72 ℃ 59 s，共30个循环；72 ℃ 7 min。得到长217 bp的PCR产物。将10µL的PCR产物与10 U MboI 37℃共同水浴8 h，2%琼脂糖凝胶分离酶切产物。T等位基因为出现129、88 bp的2个条带，C等位基因仅出现217 bp的1个条带。

1.2.3 GRIN2B基因rs4998386位点T/G多态性观察 上游引物序列为5'-GGTGGCAACTATTACATTCT-3'、下游引物序列为5'-CTTTACCACCACCAAATCCC-3'。反应条件为94 ℃ 3 min；94 ℃ 40 s、58 ℃ 45 s、72 ℃ 45 s，共30个循环；72 ℃ 6 min。得到长193 bp的PCR产物。将10µL的PCR产物与10 U Hph Ⅰ37℃共同水浴8 h，2%琼脂糖凝胶分离酶切产物。T等位基因为出现125、68 bp的2个条带，G等位基因无Hph Ⅰ酶切点，只出现193 bp的1个条带。

1.3 统计学方法 实验数据在Dbase软件中建立数据库，采用SPSS22.0软件进行统计分析。计量资料以±s表示，组间比较采用t检验。率的比较采用χ2检验或校正χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组GRIN2A基因rs4998386位点T/C多态性分布比较 PD组与对照组基因频率及基因型频率关系均符合Hardy-Weinberg平衡定律（P均＞0.05）。PD组GRIN2A基因rs4998386位点T等位基因和TC基因型分布频率均高于对照组（P均＜0.05）。见表1。

表1 两组GRIN2A基因rs4998386位点T/C多态性分布比较[例（%）]

2.2 两组GRIN2B基因rs4998386位点T/G多态性分布比较 PD组与对照组各等位基因和基因型分布频率差异均无统计学意义（P均＞0.05）。见表2。

表2 两组GRIN2B基因rs4998386位点T/G多态性分布频率比较[例（%）]

3 讨论

PD是较常见的中枢神经系统退行性疾病。既往研究认为，PD是遗传基因和环境相互作用的结果，而越来越多的研究证实，PD的发病与基因有关。目前，越来越多的证据支持谷氨酸盐氧化应激在PD发病与进展中的作用。NMDAR是谷氨酸门控的离子型谷氨酸盐受体[2]，与中枢神经系统的许多功能有关，其基因变异尤其亚型基因变异与神经系统功能异常密切相关[3]。

近年对NMDAR基因多态性、脑脊液水平变化及相关免疫方面的研究结果显示，NMDAR在细胞退行性改变的发生中发挥作用[7-8]。NMDAR高表达可以影响黑质纹状体网状结构阻断，进而纠正PD的运动障碍症状。研究发现，NMDAR离子门控通道是异聚体，主要由NR1、NR2亚单位组成，编码基因分别为GRIN1、GRIN2。GRIN2又有4个亚型即GRIN2A、GRIN2B、GRIN2C、GRIN2D。大量NMDAR连续活化会导致细胞内钙离子含量和代谢酶活性升高，触发一系列反应，包括线粒体细胞膜去极化、半胱氨酸谷氨酸蛋白酶活化、细胞毒性、氧化应激增强、氧化代谢产物蓄积和氮离子自由基丢失，最终引发神经细胞变性、死亡。研究显示，PD神经元谷氨酸盐相关能量代谢减低，谷氨酸盐神经递质系统和线粒体功能受损与PD的病理生理机制相关，PD的病理改变是神经递质功能异常和能量代谢受损共同所致。一方面可能是由于其线粒体功能障碍，另一方面可能是由于基因变异导致神经元功能或突触间作用活性降低[9]。有假说认为，谷氨酸受体激动剂对突触内NMDAR亚基和纹状体突触具有可塑性，从而影响锥体外系神经细胞功能，造成肌张力改变[10-11]。有学者通过对PD海马细胞进行研究发现，NMDAR含量过高可造成海马区神经细胞氧化应激增强、细胞退变和坏死[12]。

GRIN2A编码NMDAR关键亚单位ε，GRIN2A基因rs4998386多态性与具有保护作用的咖啡碱相互作用可增加PD发生的危险性。尽管目前研究没有证实GRIN2A基因rs4998386多态性与PD的关联[13-14]，但Meta分析认为两者之间很可能存在相关性[15-16]。在哺乳动物中，GRIN2B可激活谷氨酸盐的结合位点及主导兴奋性神经传导递质受体。GRIN2B基因变异在亚洲人群中常见[13]。多项研究认为，GRIN2B基因变异与亚洲人群患PD有关。HASSAN等[17]认为，GRINB基因多态性有望作为评估PD的标志物。还有研究者认为，PD患者的脉冲式控制和相关行为表现与GRINB基因多态性有关[18-19]。

动物实验表明，针对NMDAR的竞争性和非竞争性拮抗剂均可减轻PD的症状。NMDAR拮抗剂对PD的抑郁、认知等非运动症状也有明确干预效果，这更支持NMDAR与PD的关联[20-24]。至今惟一用于临床治疗PD的抗谷氨酸盐药物为金刚烷胺，其可通过非竞争性阻抗NMDAR[25]。因此，本研究锁定近年NMDAR相关研究中关注较多的GRIN2A、GRIN2B基因的rs1805476位点多态性进行分析，旨在初步探寻PD发病的相关基因。

本研究选取天津地区确诊的PD患者及健康对照者各104例，对他们的GRIN2A T/C和GRIN2B T/G基因位点基因型和等位基因进行分析。本研究结果显示，PD组GRIN2A基因rs4998386位点T等位基因和TC基因型分布频率高于对照组；两组GRIN2B基因rs4998386位点T/G各等位基因和基因型分布频率差异无统计学意义。这提示GRIN2A基因rs4998386位点T等位基因和TC基因型可能与天津地区PD的遗传易感性有关；而GRIN2B基因rs4998386位点T/G多态性可能与PD的发病关联性不大。然而，鉴于地域、种族、样本含量、实验技术等客观因素的影响，以上研究结论仍有待进一步验证。