核黄素光化学法抑制全血细胞因子活性的研究

周群刚，徐 军

（苏州市中心血站，江苏 苏州 215006）

随着科技水平和医疗技术的迅速发展，输血作为临床治疗的重要手段在疾病的治疗中发挥了极其重要的作用。临床医生和研究者除了探讨输血的临床功效以外，输血安全作为临床使用的前提和重中之重，受到强烈关注。因此，由输血带来的各种医疗安全问题和副作用成为近年来研究的热点。尽管采取了各种积极有效的血液安全干预措施，包括严格的血清学和核酸检测、献血后跟踪等，输液传播感染仍有可能发生。

输血风险主要包括感染性输血风险和免疫介导的输血不良反应[1]。免疫介导的输血不良反应主要分为4大类：溶血性输血反应、发热反应、过敏反应、输血相关性移植物抗宿主病。输血相关性移植物抗宿主病是指受血者不能清除供体血液中具有免疫活性的细胞，致使其在受血者体内存活、增殖，最终将受血者的器官组织作为靶目标进行免疫攻击和破坏。该病在没有预防措施时，发病率为1%，病死率高达80%～90%，是一种致命性的输血并发症。为了输血安全，必须采用有效、科学的方法将血制品在输注过程中可能产生的免疫性输血不良反应降到最低。

近30 年来，科学家们研究的病原体灭活技术大部分都集中在利用不同种类或剂量的光敏剂配合适宜光照辐射的光化学法。光化学方法能够达到比较好的灭活效果，并且对血液中的有效成分影响小，部分方法已经应用到临床阶段，如亚甲蓝等[2-4]。但是采用亚甲蓝灭活法，仍然存在生物安全方面的风险[5-6]。当前各国血液机构常规选用的血液灭活的方法是γ射线辐照，但是设备昂贵且存在辐射。核黄素，也称维生素B2（riboflavin），它是人体所需的必要微量元素，通过电子转移可使核酸链断裂，可用于血液灭活。同时经紫外线照射后的产物也与人体代谢产物相似，不会对人体产生额外损伤[7]，因此利用紫外光照射核黄素进行血液灭活，进而抑制细胞产生细胞因子是目前的主流研究方向。

本研究将采用合适剂量的核黄素在紫外光照射下，对血液进行灭活，重点对灭活后血液中细胞因子的抑制作用进行详细的研究。

1 材料与方法

1.1 材料 血浆血液（苏州市中心血站提供），PAXgene blood RNA tube采血管（BD公司），HiScript RT SuperMix for Qpcr（Vazyme），Marker（D2000），引物（金唯智），核黄素（Sigma），生理盐水（科伦药业）。

1.2 方法

1.2.1 实验仪器：涡旋震荡仪，离心机，Nanodrop 2000分光光度计（Thermo），Tanon 3500凝胶成像仪，ABI 7900荧光定量PCR仪。

1.2.2 配置核黄素溶液：称取一定量的核黄素粉末，用生理盐水稀释，终浓度为300 μmol/L。

1.2.3 血液灭活：将300 μmol/L的核黄素溶液与血液样本混匀，得到核黄素200 u浓度的待灭活共混液。对照组在37 ℃保温箱中，实验组放入血液灭活仪，设置合适的功率灭活20 min，完成实验后两组样品同时取出。

1.2.4 样本采集：上述样本使用BD公司的PAXgene blood RNA tube进行样本采集，可在室温保存3 d，2 ℃～8 ℃保存5 d，-80 ℃可保存50 个月。具体操作为：采血以后，颠倒混匀 8～10 次，在4 ℃过夜后转入-20 ℃中保存。采用TRIzol法提取总RNA。

1.2.5 逆转录合成cDNA：按以下反应程序配制反应液：模板RNA 1 μL，4× gDNA wiper Mix 4 μL，RNase free水补充至16 μL，42 ℃孵育2 min；随后在上述反应液中加入5× HiScript ⅢqRT SuperMix 4 μL，37 ℃孵育15 min，然后85℃孵育5 s终止反应。

1.2.6 实时荧光定量聚合酶链式反应（quantitative real-time polymerase chain reaction, qPCR）：按表1配置反应体系。反应程序如表2。

表1 反应体系

表2 qPCR反应

2 结果

2.1 引物设计及验证 选择全血样本中相关细胞因子的基因设计扩增引物，GAPDH作为内参基因，使用荧光定量PCR对上述基因表达进行检测。相关基因及引物如表3。

表3 引物序列

引物合成后使用半定量PCR对各个基因的引物在56 ℃、58 ℃不同退火温度下的扩增效率进行鉴定，产物凝胶电泳图如图1所示，1、2对应IL2，3、4对应IL1B，5、6对应TNF，7、8对应IFNGR1，9、10对应IL6，11、12对应IL10，13、14对应NFKB1，15、16对应SPRED2，21对应GAPDH。根据细胞因子对血液灭活效果评价的影响和引物扩增情况，选择IL1B、TNF、IFNGR1、IL6、IL10进行荧光定量检测。

图1 扩增产物凝胶电泳

2.2 细胞因子基因表达 基于核黄素灭活前后血液样本细胞因子基因的定量分析，IL1B、IFNGR1、IL6、TNF、IL10的基因表达都有所降低，其中IL1B、IL6、TNF、IL10在经过核黄素灭活后细胞因子的含量下降明显，差异有统计学意义（P＜0.05，图2）。说明血液样本经过核黄素光照处理后，样本中细胞因子的产生被阻断。

图2 基因表达情况

3 讨论

国内外医疗机构广泛使用的光化学法血液病原体灭活技术主要有以下几种：有机溶剂法、亚甲蓝光化学法、补骨脂素（S-59）光化学法、核黄素光化学法[8]。

其中亚甲蓝灭活技术已经在欧洲和我国应用于临床多年，目前对该技术争议的焦点主要为3个方面：毒性、致敏和临床疗效。现代毒理学认为致畸性应用更科学的动物实验加以证明，目前尚无报道亚甲蓝在对动物致畸性方面的相关实验研究。亚甲蓝的致敏性虽然引起广泛关注，但是发生率较低且可以通过过敏试验预防。有关亚甲蓝血浆的临床疗效问题，文献报道多有争议，仍需大规模Ⅳ期临床试验做进一步评价[9-10]。

理想的血液病原体灭活技术，一方面要求能够有效灭活血液中病原体，另一方面还需满足安全、无毒或者低毒的要求。相较于其他血液灭活试剂，核黄素具有更好的安全性和更优异的有效性。其他的灭活试剂大部分要在灭活后经过特定步骤进行过滤，这些方法会加大灭活处理过程的复杂程度和成本，而核黄素作为机体内正常存在且不可缺少的物质，不需要特殊处理，因此核黄素被欧盟、美国认定为安全有效的血液灭活试剂[11-12]。

本研究以核黄素作为灭活添加物，大大简化了血液灭活的操作步骤，减少了单位血液灭活成本，同时提高了医疗用血的安全性和使用效率。本研究中，经过核黄素处理的血液样本所包含的IL1B、IFNGR1、IL6、TNF、IL10等细胞因子得到了不同程度的抑制，尤其是对IL1B、IL6、TNF、IL10的抑制效果明显，证明了核黄素的血液灭活效果。在实际工作中使用核黄素的血液灭活技术操作简单、试剂来源多、价格便宜，可供选择光源波长范围大，为今后的临床应用和研究提供了极好的前景。该技术对于医疗欠发达地区来说是一种安全有效、价格低廉的血液灭活技术，更容易被临床应用，使输血更加安全可靠。