Capture-P方法检测血小板抗体阳性血液病患者的流行特点

左元玲，杨 晔，张建明，王佳怡

（1.苏州大学附属第一医院输血科，江苏 苏州 215006；2.苏州大学附属第一医院血栓与止血实验室，江苏 苏州 215006；3.苏州市立医院本部检验科，江苏 苏州 215002）

血小板抗体主要为HLA-Ⅰ类抗体，还有部分HPA抗体且多与HLA-Ⅰ抗体同时存在。血小板抗体除与妊娠、骨髓移植、输血小板等免疫刺激有关[1]，女性、高龄和疾病等都是血小板抗体产生的风险因素[2]。这些因素的存在，可以使血小板产生或者加快产生抗体。血小板抗体可以引起输注无效、新生儿同种免疫性血小板减少症、血小板输注后紫癜、被动异体血小板减少性紫癜以及移植相关同种异体免疫性血小板减少症[3-5]。我院血液病患者居多，因其病程长，经常需要反复输血小板，导致这类患者成为我院血小板抗体阳性的一大人群。急性髓细胞白血病（acute myeloid leukemia, AML）和急性淋巴细胞白血病（acute lymphoblastic leukemia,ALL）是常见的两种血液病，且其发病率相对较高，目前有效的治疗方法仍然是进行造血干细胞移植。移植前患者一旦产生针对供者的抗-HLA抗体即DSA（donor-specific anti-HLA antibodies），将增加移植失败的概率，植入细胞功能降低，甚至会减少生存期限[6-7]。既往研究[2,8]发现骨髓增生异常综合症（myelodysplastic syndrome, MDS）除了容易产生Rh同种抗体还容易产生HLA类抗体。所以临床工作中，要警惕该类人群抗体出现，及时检测抗体。现对2014年7月我院开展该检测项目以来，5 年内三类阳性患者的临床特征进行回顾性分析，总结血小板抗体产生的流行特征，为临床预防、诊断和早期去除血小板抗体提供依据，现统计分析如下。

1 材料与方法

1.1 临床资料 收集2014年7月1日—2019年7月1日进行血小板抗体鉴定的AML、ALL和MDS病人共520例。年龄分布为7～81 岁，中位年龄42 岁。疾病分类参照世界卫生组织（WHO）。其中AML患者343例，ALL患者101 例和MDS患者76 例。

1.2 实验方法 将患者EDTA-K2/Na2抗凝全血，经1 728×g离心5 min收集患者血浆。混合O型血小板悬液，由ACD-A液保存的O型血小板（由苏州市红十字血液中心提供）随机挑选3～5 份混合制备。所有操作由NEO血型仪设定。首先在血小板抗体检测微孔板中各加入混合的O型血小板悬液50 µL，45 ×g～65 ×g离心5 min。用生理盐水洗涤6 次，立即向每个微孔板中加入100 µL低离子盐溶液。36℃～38 ℃孵育45 min，再次用生理盐水洗涤6～8次，各加入50 µL血小板抗体检测指示红细胞（包被有兔抗人IgG），700 ×g～900 ×g离心1 min，机器判读结果。此实验同时设定阴阳对照，试剂购自IMMUCOR公司。

1.3 观察指标 本研究对所有血小板抗体鉴定阳性患者的性别、疾病诊断、年龄、输血小板次数等进行分组统计。疾病分为：AML、ALL和MDS；性别分为：男和女；年龄分为：小于30 岁、30～50岁和大于50 岁。输血小板次数分为，小于5 次、5～10 次和大于10 次。

1.4 统计学方法 本研究统计数据采用SPSS 21.0统计软件，计数资料采用卡方检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。三组之间两两比较，检验水准调整为P＜0.025。

2 结果

2.1 血小板抗体在患者性别、疾病和年龄中的差异5 年内共完成检测实验12 534 例，其中阳性患者913例，阳性率为7.3%。AML、ALL和MDS阳性患者共520 例，占总阳性患者57.0%。女性308 例，中位年龄42 岁；男性212 例，中位年龄43 岁。AML患者343 例，ALL患者101 例，MDS患者76 例。结果发现女性、AML和30～50 岁患者，血小板抗体阳性率较高。（表1）

表1 血小板抗体在不同性别、疾病和年龄中的分布情况Tab.1 Distribution of platelet antibodies in different genders,diseases and ages

2.2 输血小板次数对血小板抗体产生的影响 未经外院输血小板治疗且初诊血小板抗体鉴定阴性，经治疗和输血小板后转阳性患者，共计79 例。其中AML 61 例、ALL 13 例、MDS 5 例。随着输血小板次数增多，抗体阳性患者的阳性率增加，输血小板次数大于10 次抗体阳性率明显高于其他两组（58.2% vs 15.2%，58.2% vs 26.6%，P＜0.025）。其中AML组，随着输血小板次数增加，阳性抗体人数亦增加，且当输血小板次数大于10 次，抗体阳性率明显高于其他两组（P＜0.025）。ALL和MDS组，由于两者总样本数较少，采用Fisher确切概率法检验。ALL组间差异无统计学意义（P＞0.025）；MDS组，输血小板次数＜5 次较其他组更易产生抗体（P＜0.025）。（表2）

表2 血小板输注次数对血小板抗体产生的影响Tab.2 Risk of platelet transfusions on antibodies occurrences

3 讨论

1987年，Kiefel等[9]第一次报道了检测血小板膜抗原相关抗体的检测方法，即单克隆抗体俘获血小板抗原技术（monoclonal antibody immobilization of platelet antigens, MAIPA），但是由于该试验的操作比较耗时，而且需要新鲜血小板，导致其大范围应用受限。1989年，基于固相法检测血小板抗体的实验即Capture-P方法问世以来，因为其操作简单、快速，取得了较为广泛的认可，如今已经成为临床血小板抗体鉴定的常用方法。同时对比研究[10]发现，利用Capture-P方法可以获得比酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）和淋巴细胞毒试验（lymphocytotoxicity test, LCT）更高的敏感性。我院2014年7月—2019年7月共为12 534例血液病患者进行血小板抗体鉴定，血小板抗体阳性率为7.28%，检测人数之多，是前所未有的。

913例血小板抗体筛查阳性，AML、ALL和MDS患者共520 例，占总阳性患者一半以上（57.0%），说明这三类患者是抗体产生的主要人群。对三类患者进一步分析，女性患者为308 例，男性患者为202 例，说明女性比男性更易产生抗体。这可能与女性患者妊娠史有关，既往文献[2]报道，妊娠确会增加患者产生抗HLA抗体风险。女性患者生育经历就是一次被动免疫，如果胎儿与母体HLA-Ⅰ抗原不相合，分娩时母亲就会产生抗胎儿HLA-Ⅰ抗体，而且随着妊娠次数增多，母亲抗体产生概率增加。但是由于本研究中，患者妊娠史纪录不够详尽，导致相关数据缺失。520 例患者中，AML患者343 例，明显多于ALL和MDS患者，这项研究与Huo等[2]报道MDS为HLA抗体高发人群不同。可能由于本研究选取病例范围有限，还需扩大样本，进行多中心研究。另外，我们得出，30～50岁患者更易产生血小板抗体。这与疾病本身的年龄分布有关，本研究中520 例AML、ALL和MDS患者的中位年龄为42 岁，这可能是导致抗体阳性患者年龄分布亦主要为30～50 岁之间的因素。

520例患者中，仅筛选出79 例未经外院输血小板治疗且初诊血小板抗体鉴定阴性患者。对79 例患者进行随访跟踪，发现血小板抗体阳性率随着输血小板次数增多而增高，输血小板次数大于10 次出现血小板抗体阳性最高（58.2%），分别高于小于5次（15.2%）和5～10 次（26.6%）（P＜0.025）。ALL和MDS组分别有13 例和5 例患者纳入统计分析，MDS组提示虽然输血小板次数小于5 次就出现较高的血小板抗体阳性率，但是由于样本例数较少，缺乏一定可信性，需要进一步搜集数据，扩大样本例数，有可能进一步进行多中心研究。

通过本研究发现，女性、AML和30～50 岁是血小板抗体产生的风险因素，输血小板次数大于10次与抗体的产生有关。该研究结果可以指导临床尽早监测血小板抗体，预防抗体产生，为了避免血小板抗体对血液病患者产生不良预后影响提供依据。