复发性流产患者NKT细胞、DNT细胞、T细胞亚群的变化探讨

李想 李满元 王宏亮 孙雨婷 王佳美

与同一配偶发生连续≥2次自然流产称为复发性流产,是妇女妊娠期一种常见的并发症［1］。严重影响女性生理及心理健康,造成复发性流产的病因复杂,已知病因包括生殖道异常、染色体异常、内分泌失调、自身免疫性因素等。引起不孕不育的因素很多,相关研究结果表明,免疫学因素对于不育及正常妊娠起到了至关重要的影响［2］。自然性杀伤T细胞(natural killert,NKT细胞)是一群同时具有NK细胞标志,又具有很多T细胞受体(TCR)的独特淋巴细胞亚群。NKT免疫细胞可以在人体内分泌大量的细胞免疫因子,参与控制人体的自身先天性免疫和自身适应性免疫。NKT细胞对于在治疗恶性肿瘤者自身免疫、抗病毒自身免疫以及其他自身免疫功能性疾病中都具有很大的促进作用。双阴性调节性 T 细胞(double negative regulatory T cells,DNT细胞)是一种即可以通过免疫诱导产生免疫耐受又可以主动调控自身免疫功能的细胞［3］。本文通过研究复发性流产患者DNT细胞、NKT细胞以及T细胞亚群的变化,旨在为不育症提供参考依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取本院2020年9月～2021年4月在生殖门诊就诊的265例复发性流产患者作为复发性流产组,145例进行健康体检妇女作为健康对照组。复发性流产组年龄25～42岁,平均年龄(30.25±4.35)岁；≤30岁129例,年龄＞30岁136例。健康对照组年龄22～45岁,平均年龄(29.15±5.68)岁。两组一般资料比较差异无统计学意义(P＞0.05),具有可比性。

1.2 方法 采用EDTAK2采集两组研究对象的清晨空腹静脉血2 ml并立即送检,检测外周血DNT细胞(CD3+CD4-CD8-)、NKT细胞(CD3+CD56+CD16+)及T细胞亚群(CD3+T、CD3+CD4+Th、CD3+CD8+Tc)水 平,不能立即检测可放4℃冰箱保存24 h。准备2只流式专用管分别加入CD45-FITC/CD8-PE/CD4-ECD/CD3-P5CD45-FITC/CD56-PE/CD19-ECD/CD3-P5亚群试剂(深圳迈瑞公司)各15 μl,再分别加入50 μl抗凝全血振荡30 s后避光反应15 min,然后再加入450 μl的溶血剂,振荡30 s再次避光反应15 min后用迈瑞的流式细胞仪上机检测。采用CD45设门圈定白细胞群。在十字门图中圈出相应细胞。

1.3 观察指标 比较两组DNT细胞(CD3+CD4-CD8-)、NKT细胞(CD3+CD56+CD16+)及T细胞亚群(CD3+T、CD3+CD4+Th、CD3+CD8+Tc、Th/Tc)水平。

1.4 统计学方法 采用SPSS22.0统计学软件进行数据统计分析。计量资料以均数±标准差 ()表示,采用t检验；计数资料以率(%)表示,采用χ2检验。P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 两组DNT细胞、NKT细胞水平比较 两组DNT细胞比较,差异无统计学意义(P＞0.05)；复发性流产组NKT细胞水平高于健康对照组,差异具有统计学意义(P＜0.05)。见表1。

表1 两组DNT细胞、NKT细胞水平比较(,%)

表1 两组DNT细胞、NKT细胞水平比较(,%)

注：与健康对照组比较,aP＜0.05

2.2 两组T 细胞亚群水平比较 两组CD3+T、CD3+CD4+Th、CD3+CD8+Tc及Th/Tc比较,差异均无统计学意义(P＞0.05)。见表2。

表2 两组T 细胞亚群水平比较(,%)

表2 两组T 细胞亚群水平比较(,%)

注：两组比较,P＞0.05

3 讨论

NKT细胞是1984年Hercend T等命名的,是一群既具有NK细胞功能又有T细胞功能的细胞。其在复发性流产患者中备受关注［4］。NKT细胞的来源目前各种说法不一,但绝大多数人认为NKT细胞对胸腺有依赖。Kronenberg等［5］通过对小鼠进行研究,发现大多数细NKT胞都是从围生期的小鼠胸腺中产生,并由DNT细胞偏离了主流进行分化发育而来。也有一些科学研究认为NKT细胞主要是从传统胸腺T细胞系统中的一个子系细胞演变而来。Baron等［6］根据NKT细胞在某些特定条件下是否存在对α-半乳糖基神经酰胺(α-galactosylceramide,α-GalCer)/CDld复合体进行反应,分为经典型和非经典型。发生复合反应的一类细胞就是经典NKT细胞,反之则是非经典的NKT细胞。

目前经典NKT细胞简称Ⅰ型,是研究较多的。Ⅰ型NKT细胞能够通过调控 Th1 与Th2有关细胞因子的生成、穿孔素介导细胞毒物质的作用和自身免疫反应问题［7］。非经典NKT细胞也被人们称为Noninkt细胞,其几乎占据了绝大多数蜕膜细胞NKT细胞,分泌Th2相关的各种细胞因子,维持正常的妊娠环境［8］。同时还可以抑制体液免疫、迟发型超敏反应的发生［9］。有报道称［10］,经典的NKT细胞在人与小鼠中具有高活性,能上调Th1相关的细胞因γ-干扰素(IFN-γ)与肿瘤坏子因子-α(TNF-α)的表达。进一步研究可以明确推断经典型的NKT细胞及其诱导下的Th1参与介导的自体免疫,阻止了男性精子与卵子结合并影响其成功着床,损伤蜕膜及滋养细胞而可能引起流产。司斯［11］发现某些习惯性流产或体外受精失败的患者体内具有高水平 NKT 细胞的表达。Boyson等［12］进一步研究发现NKT细胞活化后不但导致妊娠早、中期流产,还可引起早产。也有学者报道称［13］,NKT细胞通过产生白细胞介素-4(IL-4) 诱导Th2型免疫应答,调控 Th1/Th2 平衡,维持母胎的免疫耐受,从而获得妊娠成功。妊娠是一种免疫耐受/抑制平衡的一种状态。袁静等［14］研究发现少量的NKT细胞对维持妊娠状态有一定的促进作用。而大量的NKT细胞则会发生相反的结果造成流产［15］。本文数据与上述研究的结论相符,也进一步充分证明了NKT细胞在复发性流产患者中重要性。DNT细胞也是近年来被发现的一群T细胞,参与机体的固有免疫。目前已经被发现在恶性肿瘤、传染性疾病以及其他免疫系统疾病等方面都存在异常增高,并且会促进疾病的发展［16］。能够起到调节免疫的作用［17］。辅助性T淋巴细胞(Th细胞表型为CD3+CD4+CD8-)、NKT细胞(Tc细胞表型为CD3+CD8+CD4-)也被认为是重要的一种免疫调控细胞,当 Th/ Tc浓度升高时就会提示细胞的免疫功能亢进,反之则会提示细胞的免疫功能减退。

本文研究结果显示,两组DNT细胞、CD3+T、CD3+CD4+Th、CD3+CD8+Tc及Th/Tc比较,差异均无统计学意义(P＞0.05)。复发性流产组NKT细胞水平高于健康对照组,差异具有统计学意义(P＜0.05)。由此发现NKT 细胞具有双重调节机制,既可以增强免疫反应导致流产,也可以维持正常妊娠状态。进一步分析可以得出造成流产的NKT细胞是经典型的NKT细胞,维持正常妊娠的是非经典型NKT细胞。

综上所述,对复发性流产患者进行外周血NKT细胞的检测有着重要的意义,其即能有效提示临床复发性流产患者存在免疫系统功能异常,又能快速明确病因,对免疫异常者进行有效的干预,可帮助复发性流产患者顺利实现妊娠。