5种中草药的不同溶剂提取物对嗜水气单胞菌抑菌活性的研究

晋鹏飞 张浩然 王婷婷 陈玟珲 夏欣莹 徐杭忠 吕浩 唐毅

(1 西南大学水产学院，水产科学重庆市重点实验室，重庆 400715；2 淡水鱼类资源与生殖发育教育部重点实验室，重庆 400715；3 重庆市合川区水产发展指导站，重庆 401520)

抗生素的应用有效控制了许多水产动物疾病的发生，但也给人类身体健康和生态环境带来了许多不利影响[1]，尤其是病原菌对抗生素表现出耐药性，致使对耐药菌感染所引起疾病的治疗变得更加困难，甚至面临无药可用的局面。在水产养殖中减少抗生素的使用并最终实现水产品无抗养殖，是人们健康生活和时代发展的需要，也是未来水产业发展的必然趋势[2]。中草药用于水产动物病害防治由来已久，尤其在淡水养殖中应用广泛，因其具有天然性、多功能性、毒副作用小、低残留、不易产生耐药性和可增强免疫力等多重优点而备受关注[3-4]，是减少或替代抗生素使用的一大选择[5-7]。同时，中草药成分中的多种生物活性物质对动物机体毒素的排出能起到重要的促进作用，已被广泛应用于细菌性疾病防治上[8]。目前中草药的开发利用大多以提取物的形式形成产品，其活性成分及功效受提取方式的影响较大[9]。

嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)隶属于弧菌科、气单胞菌属[10]，是一种典型的革兰氏阴性短杆菌，为人-兽-鱼共患病病原，广泛分布于自然界各种水体环境中[11]。该菌能引起软体动物、鱼类、两栖类、爬行类、鸟类及哺乳类等多种动物全身性败血症或局部感染[12]，是水产养殖动物常见的病原菌之一。

本试验选取五倍子、乌梅、诃子、大黄和五味子等5种常用中草药，分别用50%乙醇、无水乙醇、氯仿、甲醇、丙酮、乙酸乙酯和石油醚对其进行粗提物提取，探讨不同有机溶剂的提取效果，并采用中草药提取物对嗜水气单胞菌进行抑菌、杀菌试验，以抑菌圈大小、最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)评价其抑菌、杀菌效果[13]，以期为中草药有机溶剂萃取剂的优化选择及中草药提取物在水产动物细菌性疾病防治中的应用开发提供科学依据和研究基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试中草药

试验用五倍子、乌梅、诃子、大黄和五味子等5种中草药均购自重庆鑫斛药房连锁有限公司，其提取部位见表1。

表1 试验用中草药基本情况

1.1.2 供试菌

嗜水气单胞菌由本实验室从患有消化道不同程度出血等败血症的宽体金线蛭身体上分离鉴定。

1.1.3 主要试剂和仪器

试剂：NB肉汤培养基、NB营养琼脂培养基均按常规方法配制[14]；二甲基亚砜(DMSO，>99.5%)溶液、无水乙醇、50%乙醇[使用无水乙醇和纯水1∶1(v∶v)混合配制]、氯仿、甲醇、丙酮、乙酸乙酯和石油醚，以上所有试剂均为分析纯，购于成都市科隆化学品有限公司。

仪器设备：RE-5286A旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)，AR2140型电子天平(上海菁海仪器有限公司)，SPX-258B型恒温生化培养箱(天津市泰斯特仪器有限公司)，WK-150型超微粉碎机(青州市精诚医药装备制造有限公司)，DHG-9240A型电热恒温鼓风干燥箱(上海齐欣仪器有限公司)，SHZ-DIII循环水式真空泵(巩义市予华仪器有限责任公司)，UPT-II-10T型超纯水机(四川优普超纯科技有限公司)，BCN-1360型超净工作台(天津市泰斯特仪器有限公司)，GR60DA高压灭菌器(智微厦门仪器有限公司)。

1.2 试验方法

1.2.1 中草药提取物的制备及提取率计算

采用水浴旋转蒸发器对供试中草药进行减压旋转蒸发回流提取，具体方法：将各单味中草药样品粉碎，取每种样品50 g装入圆底烧瓶，加提取溶剂浸没过药材表面1～2 cm，在50～80 ℃水浴中加热回流提取，保持沸腾约1 h，冷却约30 min，滤出滤液，在药渣中再加提取溶剂，分别进行第2和第3次加热回流约30 min，收集3次滤液，转移至经精确称量的100 mL锥形瓶中，滤液浓缩至膏状物[15]，即得到中草药提取物。精确称量盛有中草药提取物的锥形瓶质量，减去该锥形瓶空瓶质量，即为中草药提取物质量(g)。提取物经高压灭菌并密封后，置于4 ℃冰箱中保存备用。

提取率(%)=100×提取物质量/中草药生药样品质量

(1)

1.2.2 供试中草药提取物药液的配制

在中草药提取物中加入适量二甲基亚砜作为助溶剂，用无菌生理盐水稀释，配成含生药1.0 g/mL的供试药液母液。

1.2.3 中草药提取物体外抑菌圈直径的测定

用牛津杯双层琼脂平板法测定供试药液的抑菌效果。在无菌条件下，将约15 mL已灭菌的NB营养琼脂培养基倒入直径90 mm的平板内(下层)，待其凝固后再倒入约5 mL温度在50 ℃左右并混有0.1 mL供试菌菌液(1×108cfu/mL)的NB营养琼脂培养基(上层)。在凝固后的上层培养基表面放置牛津杯(内径6 mm，外径8 mm，高10 mm)，并轻压使之与培养基无空隙接触。杯中加入200 μL供试药液，在28 ℃恒温下培养16～18 h后观察结果，用游标卡尺测量抑菌圈直径。判定标准：抑菌圈直径≥20 mm，为极度敏感；15 mm≤抑菌圈直径<20 mm，为高度敏感；10 mm≤抑菌圈直径<15 mm，为中度敏感；抑菌圈直径<10 mm，为低度敏感[16]。

1.2.4 中草药最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)的测定

取供试药液母液，用无菌生理盐水稀释后配制成含生药400 mg/mL的中草药药液，采用美国临床实验室标准化委员会(NCCLS)推荐的常量稀释法测定该药液的最小抑菌浓度(MIC)，即取5组各13支灭菌小试管，在无菌条件下分别加入NB肉汤培养基1 mL，其中，1～10号管为试验管，1号管分别加入上述单味中草药药液1 mL，混匀后吸取1 mL加入2号管，依次倍比稀释至10号管，从10号管吸取1 mL药液弃去，然后向每支管中分别加入0.1 mL浓度调整为1×106cfu/mL的菌液；11号管加入0.1 mL药液作为阴性对照管；12号管加入0.1 mL菌液作为阳性对照管；13号管加入0.1 mL NB肉汤培养基作为空白对照。在28 ℃下培养24 h后观察结果，如试管中液体完全清澈，表明无细菌生长；如液体浑浊，表明有细菌生长；对于药液颜色较深、肉眼无法判断的试管，取样进一步做平板涂布培养。肉眼观察，以无细菌生长试管中的最低药物浓度为最小抑菌浓度(MIC)。吸取MIC值及其以上浓度的培养物0.1 mL涂布于NB营养琼脂平板，在28 ℃下培养24 h后观察结果，以无菌生长或菌落数<5个的药液浓度为该药物的最小杀菌浓度(MBC)。

1.2.5 数据处理

用SPSS 22.0软件对试验数据进行方差齐性检验和单因子方差分析(one-way ANOVA，LSD)。用Duncan’s多重比较方法分析组间差异显著性，设显著水平为0.05。

2 结果

2.1 不同提取溶剂对5种中草药的提取效果

不同提取溶剂对5种中草药的提取率见图1。由图1可见，同一种中草药采用不同有机溶剂提取物，其提取率是不同的，有的还存在显著差异(P<0.05)。其中，50%乙醇、无水乙醇和甲醇提取物对5种中草药的提取效果显著优于氯仿、丙酮、乙酸乙酯和石油醚，尤其甲醇的提取率最高，其提取率分别为五倍子46.09%、乌梅27.58%、诃子29.55%、大黄50.34%、五味子30.88%。提取效果相对最差的是石油醚，其提取率分别为五倍子1.98%、乌梅1.73%、诃子2.21%、大黄0.89%、五味子3.40%。不同溶剂提取物对5种中草药的提取率由高到低依次排序，五倍子：甲醇、无水乙醇、50%乙醇、乙酸乙酯、丙酮、氯仿、石油醚；乌梅：甲醇、50%乙醇、无水乙醇、乙酸乙酯、丙酮、氯仿、石油醚；诃子：甲醇、无水乙醇、50%乙醇、丙酮、乙酸乙酯、石油醚、氯仿；大黄：甲醇、无水乙醇、50%乙醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿、石油醚；五味子：甲醇、无水乙醇、50%乙醇、乙酸乙酯、丙酮、氯仿、石油醚。

注：上标相同小写字母表示差异不显著(P>0.05)，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

2.2 五种中草药不同溶剂提取物对嗜水气单胞菌抑菌圈直径的测定结果

5种中草药的不同溶剂提取物对嗜水气单胞菌均有抑菌作用，其抑菌圈直径测定结果见图2。由图2可见，不同种类中草药的不同溶剂提取物，其抑菌活性并不相同。嗜水气单胞菌对五倍子的甲醇提取物、无水乙醇提取物和50%乙醇提取物等3种醇提物均表现为极度敏感，对大黄的甲醇提取物表现为高度敏感，对五倍子、大黄和五味子的氯仿提取物以及对乌梅、大黄和五味子的石油醚提取物呈低度敏感，对五倍子的丙酮提取物等共25种提取物均表现为中度敏感。五倍子的50%乙醇、无水乙醇和甲醇提取物的抑菌圈直径显著大于氯仿、丙酮、乙酸乙酯和石油醚提取物的(P<0.05)，大黄的50%乙醇、无水乙醇和甲醇提取物的抑菌圈直径显著大于氯仿、丙酮、乙酸乙酯和石油醚提取物的(P<0.05)，其他3种供试中草药不同溶剂提取物抑菌圈直径的差异没有五倍子、大黄明显。

注：上标相同小写字母表示差异不显著(P>0.05)，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

2.3 五种中草药不同溶剂提取物对嗜水气单胞菌MIC和MBC的测定结果

5种中草药的不同溶剂提取物对嗜水气单胞菌的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)见表2。由表2可见，5种中草药的甲醇提取物均表现出相对最强的抑杀菌活性，MIC和MBC均在1.56～6.25 mg/mL；其次是50%乙醇提取物，MIC和MBC分别在1.56～12.50 mg/mL和3.13～25.00 mg/mL；再次是无水乙醇提取物，MIC和MBC分别在3.13～12.50 mg/mL和3.13～25.00 mg/mL。氯仿和石油醚提取物的抑杀菌活性相对较差甚至无杀菌作用，MIC和MBC分别在25.00～100.00 mg/mL和50.00 mg/mL～无杀菌作用。由表2还可看出，五倍子、大黄的醇提物对供试菌的抑杀菌效果明显优于其他3种中草药任何一种有机溶剂的提取物，尤其五倍子的甲醇提取物抑杀菌效果最佳，其次是大黄的甲醇提取物，二者对菌液浓度为1×106cfu/mL的嗜水气单胞菌的最小抑菌浓度(MIC)均为1.56 mg/mL，最小杀菌浓度(MBC)分别为1.56、3.13 mg/mL。

表2 5种中草药不同溶剂提取物对嗜水气单胞菌的MIC和MBC测定结果 单位：mg/mL

3 讨论

相关研究表明，多种中草药提取物对水产动物病原菌具有不同程度的抗菌活性[3-4]。然而，影响中草药抗菌活性的重要因素之一是其有效成分的提取。中草药有效成分的提取方法有多种[15,17]，其中溶剂提取法是常用方法之一，其基本原理是根据中草药中的各种成分在溶剂中的溶解性质选用适宜的溶剂，将有效成分从药材组织内溶解出来[18]。中草药提取物的提取效果和所提取有效成分类别与量的多少随所选用溶剂(提取剂)的不同而不同，其发挥的药效也相应不同[19]。从本研究结果看，3种醇溶剂(50%乙醇、无水乙醇和甲醇)对五倍子等5种供试中草药提取物(醇提物)的提取率均较高，甲醇的提取效果尤为突出，提取效果相对较差的是氯仿、乙酸乙酯和丙酮，最差的是石油醚。这表明，可选择该3种醇溶剂作为5种供试中草药提取物的萃取剂，尤以甲醇为佳。

本研究中，五倍子的3种醇提物对嗜水气单胞菌(1×106cfu/mL)的MIC分别为3.13、3.13、1.56 mg/mL，MBC分别为6.25、6.25、1.56 mg/mL。在菌液浓度为1×108cfu/mL的条件下，其抑菌圈直径分别为(21.5±0.3)、(22.0±0.8)、(24.5±0.4)mm。大黄的3种醇提物对嗜水气单胞菌的MIC分别为1.56、3.13、1.56 mg/mL，MBC均为3.13 mg/mL。在菌液浓度为1×108cfu/mL的条件下，其抑菌圈直径分别为(14.9±0.4)、(14.5±0.7)、(16.1±0.3)mm。由此可见，五倍子和大黄对嗜水气单胞菌具有较强的抑杀菌能力。推测其原因，五倍子中的主要有效成分没食子酸和鞣质可使细菌内的蛋白质变性沉淀，使胞内原生质凝固，影响细菌的各种代谢活性，从而抑制细菌生长[20]；大黄中的主要有效成分大黄素和大黄酸可使细菌DNA发生突变，造成DNA损伤，抑制细菌生长[21](大黄素)，以及抑制糖代谢中间产物氧化脱氢而与DNA结合，干扰蛋白质合成，进而抑制细菌生长[22](大黄酸)。柯圣涛等[17]的研究表明，五倍子和大黄的50%乙醇提取物对嗜水气单胞菌(8×107cfu/mL)具有较强的抑菌活性，其抑菌圈直径分别为(24.29±0.89)、(15.05±0.50)mm，这与本研究结果基本一致。姚嘉赟等[23]报道，五倍子和大黄的95%乙醇提取物对嗜水气单胞菌(1×109cfu/mL)的体外抑菌圈直径分别为(13.7±1.04)mm、≤7 mm。姜巨峰等[24]研究指出，五倍子对嗜水气单胞菌具有较强的体外抑菌能力，当菌液浓度为6×105个/mL时，其MIC只有0.780 mg/mL。这与本研究结果不同，原因可能与中草药本身的质量、供试菌液和萃取剂浓度、提取工艺等不同有关。

本研究结果表明，五倍子和大黄的3种醇溶剂(50%乙醇、无水乙醇和甲醇)提取物对嗜水气单胞菌均具有较强的抗菌活性，但其抗菌的功能性成分有待于进一步分析研究。另外，本试验所选取的5种中草药中，乌梅、诃子未列入2020版“水产养殖用药明白纸”已批准的水产养殖用兽药名录，因此，在养殖生产中应注意用药规范、用药安全。