益母缩宫颗粒对不全流产模型大鼠相关炎症因子水平的影响

侯汪欢，毛惠

（1.西南医科大学,四川 泸州 646000；2.西南医科大学附属中医医院产科,四川 泸州 646000）

0 引言

随着社会发展，在诸多社会因素的共同作用下，我国未婚女性数量逐年递增，婚前性行为、婚前同居、未婚先孕等行为增加，导致我国女性遭受意外妊娠、人工流产甚至多次人工流产概率逐年上升。通过中国卫生健康统计年鉴查阅2019年全国人工流产人数达到976 万人不等[1]，且部分私人诊所、违规诊所接待的人工流产患者未被统计在内。一项对全国30个省市自治区近300 家医院近8 万人工流产妇女的调查发现，重复流产比例高达65.2%[2]。我国女性的健康在人流率、人流数双高的局势下遭受到了危害[3]。

相比手术流产，药物流产具有经济实惠、安全性高、创伤小、疗效显著、易接受、副作用小等优点，药物流产的临床指南表明米非司酮和米索前列醇配伍使用有效率达95%[4]。流产会激活局部的炎性细胞，诱导大量炎症因子的合成及释放，如NO、前列腺素等炎症介质以及TNF-α 和 IL-6 等促炎性细胞因子，从而导致机体出现一系列的炎症反应不利于流产后子宫复旧，导致阴道异常出血[5]。因此进一步探讨益母缩宫颗粒能否调节相关炎症因子的表达，减轻子宫内膜炎症反应，降低药物流产后感染的风险，进一步揭示其作用机理，为临床治疗药物流产后子宫异常出血提供合理、适用的手段。

1 实验材料

1.1 实验药品

益母缩宫颗粒，独立小包装（10g/ 袋），生产批号：20201204，大鼠用药剂量按照成人用药量（30g/d）来计算。换算后益母缩宫颗粒低、中、高剂量组大鼠灌胃浓度分别对应为：1.56g/(kg·d)、3.13g/(kg·d)、6.25g/(kg·d)。

新生化颗粒，规格9g/袋，国药准字号：Z2016 3013，成人用量27g/d，换算后新生化颗粒灌胃浓度1.56g/(kg·d)。

米非司酮片，批号：432005041，规格25mg/片，华润紫竹药业有限公司生产，灌胃浓度：8.3mg/kg。

米索前列醇片，规格0.2mg/ 片，产品批号：43200304，华润紫竹药业，灌胃浓度：100μg/kg。

苯巴比妥钠，规格0.1g/瓶，生产批号：190503，上海上药新亚药业。

1.2 实验主要试剂和仪器

1.2.1 实验试剂

一氧化氮测试盒 货号：S0159O-2 南京建成

大鼠TNF-αELISA 试剂盒 货号：MM-0180R2江苏酶免

大鼠IL-6ELISA 试剂盒 货号：MM-0190R2江苏酶免

1.2.2 实验仪器

电子分析天平（瑞士PRECISAXB220A）、组织研磨仪器（HF-48，上海净帆贸易有限公司）、冷冻离心机（TGL16M 台式高速冷冻离心机）、酶标仪（Rayto,RT-6100）、移液枪、-80℃冰箱、4%多聚甲醛固定液、玻片、大鼠灌胃针、烧杯、玻璃棒、滴管、棉球、注射器、解剖固定板、组织剪、眼科剪、镊子、采血管、采血针、置物架、纱布、无菌手套等。

1.3 实验动物

均来源于西南医科大学实验动物中心，许可证号 ：SCXK（川）2018-17，选取性成熟SD 雌性大鼠48只，体重220～250g，雄性大鼠20只，体重250～280g，饲养于西南医科大学实验动物中心忠山动物房，许可证号 SYXK（川）2018-065。实验期间充分供给食物和水源，人工模拟光照（白天和黑夜各12h），动物房温度维持在21℃-23℃，湿度60%±20%。

2 实验方法

2.1 不全流产大鼠造模

随机挑选出8只未合笼雌性大鼠作为空白组（D 组），剩余雌鼠参照王晓东造模法[6],按照雄鼠：雌鼠=1:2 的比例进行合笼，合笼时间选择每日下午18:00，次日晨08:00 检查雌鼠阴栓或阴道涂片，查见阴栓或精子则判定为妊娠第1 天，未孕大鼠继续合笼至判定为妊娠。妊娠大鼠于怀孕第 7天上午08:00 灌胃米非司酮（8.3mg/kg），同日下午18:00 灌胃米索前列醇(100μg/kg)，灌胃后于阴道内置入1 大小适宜无菌棉球，若造模成功则第二天早晨于雌鼠阴道内棉球上可见部分血迹。

2.2 动物分组及干预措施

建模成功后的雌鼠被随机分为5 组，分组情况为模型组（E 组）、益母缩宫颗粒低剂量组（A 组）、益母缩宫颗粒中剂量组（B 组）、益母缩宫颗粒高剂量组（C 组）、新生化颗粒组（F 组），每组各8只。其中D、E 组灌胃动物饮用水，连续7 天，余组灌胃对应浓度药物，连续7 天。

2.3 标本采集

各组大鼠予以相应干预措施处理后，入组第8天予以10%苯巴比妥钠行腹腔注射麻醉，麻妥后将大鼠固定于解剖板上，消毒完毕后沿腹部正中切开，迅速进腹，找到粉红色 Y 型子宫组织，从卵巢下端至宫颈口处完整离断子宫，一部分置于4%多聚甲醛固定液中，一部分置于1.5mLEP 管冻存于-80℃冰箱中，对取材后的标本做好标注，以便检测。

2.4 大鼠子宫组织匀浆NO、TNF-α、IL-6 的检测方法

称取约0.1g 子宫组织，梯度解冻，按照子宫组织（g）：0.9%氯化钠注射液（mL）=1:9 进行冰浴匀浆，离心机转速3000r/min，温度4℃，离心10min，取上清液沸水（95-100 ℃）5min 后，于3000r/min再离心5min 后取上清液，置于冰上待测。严格按照Elisa 试剂盒说明书对TNF-α、 IL-6 水平进行测定，严格按照硝酸酶还原法试剂盒说明书检测子宫组织匀浆中NO 含量。

2.5 统计学方法

采用 SPSS 23.0 统计软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示。数据分布符合正态性且方差齐性的多组资料采用完全随机设计的方差分析（one-way ANOVA）进行统计分析，采用 LSD 法进行组间比较；肿瘤坏死因子a 数据不符合正态分布，采用秩和检验法（KrusKal-Wallis检验）进行统计分析。P＜0.05 则差异有统计学意义。

3 实验结果

3.1 大鼠子宫组织匀浆NO 含量

与E 组相比，B、C、F 组大鼠子宫组织匀浆中NO 含量明显降低,差异有统计学意义（P＜0.01）,A组大鼠子宫组织匀浆中NO 含量差异无统计学意 义（P＞0.05）；与F 组 相 比，A 组 大 鼠子宫组织匀浆中NO 含量明显升高，差异有统计学意义（P＜0.01），B、C 组大鼠子宫组织匀浆中NO 含量差异无统计学意义（P＞0.05）。

3.2 大鼠子宫组织匀浆TNF-α 含量

与E 组相比，各组大鼠子宫组织匀浆中TNF-α的含量均下降，差异有统计学意义（P＜0.05）；与F组相比，A、B 组子宫组织匀浆中TNF-α 的含量差异无统计学意义（P＞0.05），C 组子宫组织匀浆中TNF-α 的含量差异有统计学意义（P＜0.05）。

表1 各组大鼠子宫组织匀浆NO 含量(±s)

表1 各组大鼠子宫组织匀浆NO 含量(±s)

注：与D 组 相 比，*P＜0.05，**P＜0.01；与E 组 相 比，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；与F 组相比，#P＜0.05，##P＜0.01

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表2 各组大鼠子宫组织匀浆TNF-α 含量(±s)

表2 各组大鼠子宫组织匀浆TNF-α 含量(±s)

注：与D 组 相 比，*P＜0.05，**P＜0.01；与E 组 相 比，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；与F 组相比，#P＜0.05，##P＜0.01

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3.3 大鼠子宫组织匀浆IL-6 水平

与E 组相比，各组大鼠子宫组织匀浆中IL-6含量明显降低，差异有统计学意义（P＜0.01）；与F组相比，A、B 组大鼠子宫组织匀浆中IL-6 含量未见统计学差异（P＞0.05），C 组大鼠子宫组织匀浆中IL-6 含量差异有统计学意义（P＜0.05）。

表3 各组大鼠子宫组织匀浆IL-6 水平(±s)

表3 各组大鼠子宫组织匀浆IL-6 水平(±s)

注：与D 组 相 比，*P＜0.05，**P＜0.01；与E 组 相 比，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；与F 组相比，#P＜0.05，##P＜0.01

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研究结果表明益母缩宫颗粒能降低药物不全流产大鼠子宫组织匀浆中NO、TNF-α 和IL-6 的水平，与新生化颗粒组相比，益母缩宫颗粒高剂量组TNF-α 和IL-6 降低，表明其改善炎症因子、减轻炎症方面效果优于新生化颗粒，其治疗药物流产后异常子宫出血的机制可能与减轻子宫组织炎症反应、防止宫腔感染有关。

4 讨论

药流后异常子宫出血与宫腔感染密切相关，长期反复阴道流血容易导致子宫内膜炎、盆腔炎、月经紊乱、继发不孕、贫血、免疫力低下等，在孕早期感染是导致堕胎相关死亡的最常见的原因[7]。其中在炎症发展过程中起到核心作用的是TNF-α，在炎症初起时扮演调节免疫、提高抗感染能力的免疫调节因子的角色，同时还能扮演诱导炎症介质、引发局部炎症反应的促炎因子角色，主要通过刺激内皮细胞产生黏附因子产生作用，最终造成子宫组织的损害[8]。参与炎症反应的主要诱导者是IL-6，各组织炎症的严重程度可以由该项指标来反映，主要原理是因其参与了炎症反应毒性作用的催化和放大，从而造成了组织细胞的损害[9]。

药物流产后异常子宫出血属祖国医学“堕胎下血、产后恶露不绝、胞衣残留”等诊治范畴。益母缩宫颗粒在生化汤基础上加益母草、枳壳、生蒲黄，增强了行气止痛、活血化瘀的疗效，在前期临床研究和动物研究中均证实益母缩宫颗粒能够显著缩短阴道流血时间,促进蜕膜绒毛组织排出,减轻炎症,促进子宫内膜修复[10]。本研究显示益母缩宫颗粒能降低子宫组织匀浆NO、TNF-α、IL-6 含量，其治疗药物流产后异常子宫出血的机制可能与减轻子宫组织炎症反应、防止宫腔感染有关，其在改善炎症因子、减轻炎症方面效果优于新生化颗粒，值得在临床上推广使用。