鱼腥草治疗角膜炎的网络药理学分析

李 双 陈绍文 韩林涛 田代志 莫国艳 李杜军

湖北中医药大学1基础医学院，2中药资源与中药复方教育部重点实验室，3中医药实验中心，4眼科教研室 湖北 武汉 430065

鱼腥草（Houttuynia cordata，HC），为三白草科植物蕺菜（Houttuynia cordataThunb.）的新鲜全草或干燥地上部分，始载于《名医别录》，被《本草纲目》列为上品，具有明目利尿、清热解毒、消肿排脓的功效，被国家卫生部正式确定为“既是药品，又是食品”［1，2］。其化学成分主要为挥发油、黄酮和生物碱，具有提高免疫力、抗感染［3-5］、抗菌、抗病毒［6-8］等多种药理活性［9］，被誉为中药广谱抗生素，于2003年入选为我国治疗SARS 的8 种药物之一［10］。鱼腥草制剂作为一种新型的抗病毒中药制剂，已被广泛应用于临床眼疾治疗［11-16］。对于角膜溃烂、干眼症及病毒性角膜炎、结膜炎，鱼腥草均有确切疗效，不仅安全、有效，且使用方便、药源广泛、不影响继续用药等，是极具开发前景与应用潜力的资源之一。

近年来，鱼腥草研究多聚焦于化学成分分离鉴定、药理活性、适应证方面，几乎为有效成分鉴定及其一般药效学探讨，缺乏更系统和深入的多成分、多靶点、多功效分子作用机制研究。尤其是鱼腥草抗角膜炎作用的物质基础与分子机制领域，当前只有相关的临床疗效观察报道［10-16］，尚无药效学研究报道，实验研究更是空白。

中医药既强调整体性，又具多成分、多靶点、多途径的特色。网络药理学作为当前的一种新研究理念，即能兼顾中医药整体性又具有多成分、多靶点、多途径特色，是一种可系统性研究中医药的方法［17］。基于此，本研究以鱼腥草治疗角膜炎为研究对象，采用网络药理学进行探讨分析，应用各种生物信息学数据库和在线分析软件，获得鱼腥草成分、靶点、角膜炎等信息，经过分析，预测活性成分与潜在作用靶点，从整体水平观察“鱼腥草-作用靶点-角膜炎”复杂网络关系，分析活性成分、作用靶点和疾病间的潜在关系，探究鱼腥草治疗角膜炎的作用机制，奠定深入开展鱼腥草治疗角膜炎实验研究的基础，为鱼腥草治疗角膜炎提供科学依据与临床应用参考。

1 材料与方法

1.1 收集角膜炎相关蛋白质靶点以“keratitis”为关 键 词 在 数 据 库DisGeNET［18］（http：//www. disgenet.org）收集与角膜炎相关的蛋白质靶点。

1.2 构建角膜炎相关蛋白质的互作网络利用数据库STRING 11.0（https：//string-db. org/），结合角膜炎相关蛋白质，以得分高于0.7 为标准，选取高置信度蛋白质互作信息，将数据导入Cytoscape 3.7.2（http：//www. cytoscape. org）构建角膜炎相关的蛋白质互作（protein-protein interaction，PPI）网络。

1.3 收集鱼腥草的化学成分通过中药系统药理学分析（TCMSP）平台［19］（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）、中国科学院化学数据库（http：//www.organchem. csdb. cn）及中医药百科全书数据库（ETCM，http：//www. tcmip. cn/ETCM/index.php/Home/），查找鱼腥草的化学成分，通过Pub-Chem、ChemSpider 等数据库，收集各化学成分的CAS 号、SMILES 结 构 式、InChIKey 名、IUPAC 名等信息。将各化学成分的SMILES 结构式信息导入 在 线 平 台SwissADME［20］（http：//www. swissadme.ch/）中，预测它们的吸收、分布、代谢和排泄（absorption distribution metabolism and excretion，ADME）参数、药动学特性、类药性、药物化学友好性，以便筛选鱼腥草的活性化学成分。

1.4 预测鱼腥草活性化学成分的潜在靶蛋白将上步所筛得的活性成分SMILES 结构式在SwissTargetPrediction 平 台［21，22］（http：//www. swisstargetprediction.ch）上，应用“反向药效团匹配法”得到各活性化学成分的潜在靶点和生物活性结果。

1.5 构建鱼腥草治疗角膜炎的活性成分-潜在靶点网络利用Cytoscape 3.7.2 的Merge 功能，将角膜炎相关蛋白的PPI 网络、鱼腥草活性成分-预测靶点网络进行合并，构建鱼腥草治疗角膜炎的活性成分-潜在靶点网络。

1.6 GO 富集分析、KEGG 通路富集分析将鱼腥草治疗角膜炎的活性成分-潜在靶点网络中的靶点蛋白信息，导入WebGestalt（WEB-based GEne SeT AnaLysis Toolkit，http：//www. webgestalt.org）［23］中，进行GO 分析（生物过程、细胞组分和分子功能）与KEGG 分析。

1.7 构建“成分-靶点-通路”网络将上述所得的KEGG 信号通路、鱼腥草活性成分、潜在作用靶点数据，导入Cytoscape 3.7.2 软件，构建鱼腥草治疗角膜炎的“成分-靶点-通路”网络。

2 结果

2.1角膜炎相关的PPI 网络在数据库DisGeNET 中，检索到146 个与角膜炎相关的一级蛋白，见表S1（可扫描本文OSID 二维码查看）。经STRING 10.0 数据库检索，筛选出48 个与一级蛋白互作的角膜炎相关二级蛋白。经软件Cytoscape 3.7.2 整合分析，构建角膜炎相关蛋白的PPI 网络（图1），包含65 个角膜炎相关蛋白质和382 条角膜炎相关蛋白质的相互作用关系。

图1 角膜炎相关蛋白质的PPI 网络

2.2 鱼腥草活性成分-预测靶点网络经TCMSP平台、中国科学院化学数据库及ETCM 数据库共检索鱼腥草化学成分72 个，见表S2（可扫描本文OSID二维码查看，化学成分以阿拉伯数字编号表示），导入SwissADME 进行预测，以Lipinski 违规参数≤1进行筛选，得到54 个活性成分。将活性成分相关信息导入SwissTargetPrediction 平台，经“反向药效团匹配法”预测，得到各活性成分的靶点蛋白，整合可能性非零的预测靶点信息，导入Cytoscape 3.7.2 进行拟构，得到鱼腥草活性成分-预测靶点网络（图2），包括含1 877 条活性成分-预测靶点联系、48 个化合物节点和619 个靶点节点。

图2 鱼腥草活性成分-预测靶点网络

2.3 与角膜炎相关的鱼腥草活性成分-潜在靶点网络应用Cytoscape 3.7.2 合并功能，将角膜炎相关的PPI 网络、鱼腥草活性成分-预测靶点网络进行合并，删除无交集靶点，构建角膜炎相关的鱼腥草活性成分-潜在靶点网络，见图3。节点之间主要连接原则为：当鱼腥草活性成分作用靶点与角膜炎靶点相同时，则活性成分节点与靶点节点联系起来，此相同靶点即为鱼腥草活性成分治疗角膜炎的潜在靶点。该网络由14 个成分节点、50 个靶点节点与160 条活性成分-潜在靶点联系所构成。其中，50 个靶点中含9 个直接作用靶点（即图3 中间小圆），包括白细胞介素（IL）-6、Toll 样受体（TLR）9、肿瘤坏死因子（TNF）等，以及41 个间接靶点（即图3 右侧大圆），主要包括IL-10、TLR2、血管内皮生长因子-A（VEGF-A）等。

图3 与角膜炎相关的鱼腥草活性成分-潜在靶点网络

应用Cytoscape 3.7.2之Network Analysis-Analyze Network 功能，分析此网络中各靶点的度值（Degree），可了解与该靶点相互作用的蛋白与鱼腥草活性成分数量（见表S3，可扫描本文OSID 二维码查看）。通常，度值大小代表着对应节点与其他节点的联系程度，暗示节点在网络中的关键性大小，Degree越大，表明作用于此靶点的鱼腥草活性成分数量或互作蛋白数量越多，暗示活性成分通过该靶点发挥作用的可能性就越大。分析结果表明9个直接靶点平均受2.22 个鱼腥草成分作用，其中靶点CD38、MAPK8、TNF、CASP1 受2 个以上鱼腥草成分作用，提示它们很可能是鱼腥草活性成分发挥作用的潜在靶点。

2.4 GO 富集分析和KEGG 信号通路富集分析应用WebGestalt，对50 个潜在靶点进行GO 富集分析及KEGG 信号通路富集分析（P＜0.05）。经GO分析，潜在靶点被注释入303 项GO 术语中，包括263 项生物过程、18 项细胞组分、22 项分子功能，并以这三项下前3 个GO 术语与作用于潜在靶点的活性成分数量进行综合分析（图4），潜在靶点明显富集于炎症反应、脂多糖细胞反应、NF-κB 转录因子活性的正调控等生物过程，多为细胞外间隙、胞外区、质膜外侧之类的细胞组分，主要具有细胞因子活性、生长因子活性、趋化因子活性等细胞功能。

图4 鱼腥草活性成分治疗角膜炎潜在靶点的GO 功能富集分析

KEGG分析表明，50个潜在靶点被富集入10条信号通路（P＜0.001），所富集入的靶点数量不小于10个，靶点富集率介于13%～29%之间，显著富集的信号通路具体为：IL-17信号通路（hsa04657）、Toll样受体信号通路（hsa04620）、百 日 咳（hsa05133）、美 国 锥 虫 病（hsa05142）、炎症性肠病（hsa05321）、类风湿性关节炎（hsa05323）、肺结核（hsa05152）、疟疾（hsa05144）、NOD样受体信号通路（hsa04621）、沙门氏菌感染（hsa05132），结果见图5及表S4（可扫描本文OSID二维码查看）。

图5 鱼腥草活性成分治疗角膜炎潜在靶点的KEGG 信号通路富集分析

2.5 鱼腥草治疗角膜炎“成分-靶点-通路”网络的构建应用Cytoscape 3.7.2 将鱼腥草治疗角膜炎的15 个活性成分、50 个潜在靶点及其所富集的10条KEGG 信号通路进行整合，构建鱼腥草治疗角膜炎的“成分-靶点-通路”网络图，结果见图6。从图6可知，不同化学成分可作用于不同靶点，也可作用于同一靶点，同一靶点可参与多条信号通路，如鱼腥草中（R）-芳樟醇（9）、绿莲皂苷元（19）、樟叶木防己碱（27）等5 种成分都可作用于角膜炎靶点MAPK8，此靶 点 可 注 释 入hsa04657、hsa04620、hsa05133、hsa05142 共4 条信号通路中，体现了中医药多成分、多作用途径的特点；另一方面，同一成分可作用多个靶点，同一靶点又可受多个成分作用，如山柰酚-3-O-葡萄糖鼠李糖苷（36）、山柰酚-3-O-A-L-吡喃鼠李糖苷（42）共3 种成分既可作用于靶点CD38，也可作用于TNF 靶点；再者，绿莲皂苷元（19）既作用于MAPK8，也作用于NTRK1；靶点MAPK8、TNF 不仅参与多条信号通路，还有多个互作蛋白，尽管NTRK1、CD38 在本研究中没有富集入任何信号通路，但CD38 受多个鱼腥草成分作用，还与TNF、IL-6相互作用，NTRK1 虽只被绿莲皂苷元（19）作用，但与NGF、VEGF-A、IKBKG 相互作用，这种交叉互作的关系不但体现了中医药“多成分、多靶点、多途径”的特色，也契合了中医药的整体性网络调控理念。

图6 鱼腥草治疗角膜炎的“成分-靶点-通路”网络图

3 讨论

本研究应用网络药理学对鱼腥草治疗角膜炎的活性成分、潜在靶点及分子机制进行分析探讨与预测。在鱼腥草已分离鉴定的72 个化学成分中有14 个成分可能是其治疗角膜炎的活性成分，包括（R）-芳樟醇（9）、新绿原酸（17）、绿莲皂苷元（19）、山柰酚（24）等；在146 个角膜炎相关靶点有50 个为鱼腥草治疗角膜炎的潜在靶点，其中有9 个直接作用靶点，包括MAPK8、CD38、TNF 等。鱼腥草化学成分中黄酮类和挥发油为主要活性成分，鱼腥草素（39）、甲基正壬酮（49）、月桂醛（5）、山柰酚（24）、槲皮素（50）是鱼腥草发挥抗炎、抑菌、抗病毒、抗氧化等药理作用的有效成分；其中鱼腥草素（39）、甲基正壬酮（49）是鱼腥草注射液、鱼腥草滴眼液等中成药的主要药效物质，可通过作用TNF-α、IL-1β、TLR4、IL-10、COX2、IL-6、TGF-β1 等靶点发挥抗炎、抑菌、抗氧化活性［2］；山柰酚（24）能作用于靶点TNF-α、IL-1β、IL-6 等而发挥抗氧化、抗炎、抗凋亡与 神 经 保 护 作 用［24，25］；槲 皮 素（50）亦 可 作 用 于TNF-α、IL-1β、IL-6 等靶点发挥其抗氧化、抗炎、抗肿瘤、抑菌等多种药理活性［26］。现有研究报道提示，TNF-α、IL-1β、IL-10、IL-8、IL-6 等与单纯疱疹性角膜炎、真菌性角膜炎直接相关［27，28］，其中，TNF、TLR9、IL-6、CXCL8（又名IL-8）也是本研究所预测的直接靶点。可见，本研究中鱼腥草治疗角膜炎之活性成分与潜在作用靶点的预测结果在一定程度上已被既往相关研究所佐证。

GO 分析结果显示，潜在靶点主要参与炎症反应、脂多糖细胞反应、NF-κB 转录因子活性正调控之类的生物过程，具有细胞因子、生长因子、趋化因子的活性，是细胞外间隙、胞外区、质膜外侧的细胞组分（图4），涉及了炎症反应、炎症调控、凋亡、免疫等多种作用，主要体现在按功能分类时，可被分为炎症反应与信号的CXCL8、cAMP、IL-6 等，先天免疫 的 CLEC7A、S100A8、IRAK1 等，凋 亡 的CASP1、S100A8、CHI3L1 等，调控炎症反应的IL-6、TNF、IL-1β、CXCL8 等。而且，潜在靶点显著富集于与炎症、感染（细菌、寄生虫）、免疫相关的通路上，包括IL-17 信号通路、Toll 样受体信号通路、百日咳等10 条KEGG 信号通路（图5）。据报道，鱼腥草具有抗炎、抑菌、抗病毒、抗氧化等多种药理作用［2］，包括鱼腥草挥发油降低COX2 表达并抑制PGE2 释放；黄酮类抑制IL-6、NO 产生；萜类化合物结合一些参与感染与炎症的蛋白质或酶而抗炎；生物碱类抑制NO 产生而抗炎；鱼腥草素对大肠杆菌、金葡球菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌、假丝酵母等具有一定的抑菌效果；成分甲基正壬酮、月桂醛、辛醛等具有直接抗Ⅰ型单纯疱疹病毒（HSV-1）、流感病毒、Ⅰ型人类免疫缺陷病毒（HIV-1）的活性；成分槲皮素、槲皮苷和异槲皮苷可通过抑制NF-κB 激活而抑制HSV-2 感染；总黄酮和多酚具显著清除羟基、超氧阴离子自由基的能力。此外，还有研究表明，鱼腥草可抑制或阻止高渗透压、VEGF 高表达所致的角膜上皮损伤［29］。这些研究结果不但证实本研究的分析结果：鱼腥草的潜在靶点显著富集于与炎症、感染（细菌、寄生虫）、免疫相关通路，还暗示鱼腥草对细菌、病毒、寄生虫病因性角膜炎存在潜在治疗作用。

综上所述，鱼腥草中（R）-芳樟醇（9）、新绿原酸（17）、绿莲皂苷元（19）等活性成分可能作用于MAPK8、CD38、TNF 等靶点，通过IL-17 信号通路、Toll 样受体信号通路、百日咳等信号通路而发挥抗炎、抑菌、抗病毒、增强免疫等活性作用。因此，“多成分、多靶点、多途径”是鱼腥草达成治疗细菌、病毒、真菌、外伤、免疫力低下等各种病因性角膜炎的根本途径，也是角膜炎的治则、治法所在，既为临床应用提供科学依据，也奠定了后续进一步开展实验研究的基础。