老年2型糖尿病合并牙周炎患者牙周病原菌检测情况分析

谢 芬,孙小春,周美燕,陈向琼,郑 旭

(海南医学院第一附属医院 口腔科,海南 海口570102)

牙周炎是由牙周病原菌引发的牙周组织感染性疾病，是人体失牙的主要因素之一[1-2]。相关研究表明，牙周炎与2型糖尿病(T2DM)能够相互促进，这是由于T2DM会在一定程度改变患者口腔免疫功能及微生态情况[3-6]。患者龈下菌斑病原菌最为常见的有具核梭杆菌(Fn)、牙龈卟啉单胞菌(Pg)等，但老年T2DM合并牙周炎患者血糖水平是否能影响其龈下菌斑病原菌情况还未有确切定论[7]。本研究通过检测老年T2DM合并牙周炎患者牙周病原菌情况，分析患者牙周病原菌感染与T2DM的关系，报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2020年4月-2021年9月海南医学院第一附属医院收治的61例单纯性牙周炎老年患者作为单纯组，纳入标准：(1)患者存在明显的菌斑；(2)出现牙龈炎症情况；(3)探诊深度(PD)≥4 mm，附着丧失≥1 mm。排除标准：(1)患者存在全身系统性疾病；(2)侵袭性牙周炎；(3)参与本研究前3个月内使用过抗生素，或1年内实施基础牙周治疗者。另选取同期37例T2DM合并牙周炎老年患者归为合并组，纳入标准：(1)患者空腹血糖(FPG)≥7.0 mmol/L或糖化血红蛋白(HbAlc)≥6.5%；(2)口服糖耐量试验2 h血糖≥11.1 mmol/L；(3)并符合单纯组的其他纳入标准。排除标准：(1)伴有其他全身系统性疾病；(2)哺乳期或妊娠期妇女；(3)参与本研究前3个月内使用过抗生素或激素类药物。两组患者对本研究知情且自主同意参与。其中单纯组男27例，女34例，年龄65-78(68.47±3.15)岁；合并组男17例，女20例，年龄66-79(68.49±3.18)岁。两组患者的基线资料比较差异均无统计学意义(P>0.05)。本研究符合并得到本院伦理委员会审批批准。

1.2 方法

标本采集：使用Gracey无菌刮治器刮取受检者上下颌第一磨牙颊舌侧龈下菌斑，将取样点隔湿后去除龈上菌斑，再以刮治器刮取患者龈下菌斑，并置于PBS缓冲液中，在-80℃状态下保存。

细菌裂解与DNA提取：将标本在12 000 rpm下进行离心处理，时间为2 min，弃去上清液，加入20L Proteinase K、180 μl Buffer GL、10 μl RNase A充分振荡后，在56℃水浴中温育10 min。加入200 μl乙醇(100%)、200 μl Buffer GB充分混匀，在12 000 rpm下进行离心处理，时间为2 min，弃去滤液；加入500 μl Buffer WA，在12 000 rpm下进行离心处理，时间为1 min，弃去滤液；加入700 μl Buffer WB，在12 000 rpm下进行离心处理，时间为1 min，弃去滤液；再次加入700 μl Buffer WB，在12 000 rpm下进行离心处理，时间为1 min，弃去滤液；12 000 rpm下再次2 min离心处理后，置于1.5 ml离心管，加入200 μl Elution Buffer，于室温下静置5 min，于12 000 rpm下离心处理后2 min，洗脱DNA。

引物合成：病原菌印务来自16S rRNA对菌斑总DNA进行扩增，包括伴放线放线杆菌(Aa)、直肠弯曲杆菌(Cr)、Fn、Pg、微小消化链球菌(Pm)、中间普氏菌(Pi)、变黑普氏菌(Pn)、福塞氏坦氏菌(Tf)，由大连宝生物工程有限公司合成，见表1。

表1 龈下菌斑病原菌引物序列、退火温度、扩增片段

细菌16SrRNA定性检测，多重PCR扩增：于50 μl体系Qiagen热启动PCR中加入10L标本。所有PCR反应重复3次。阴性对照以同体积的三蒸水代替DNA样品。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 两组患者龈下菌斑病原菌检出率对比

合并组龈下菌斑除Fn外，其余病原菌检出率高于单纯组Aa(24.32%vs.0.00%)、Cr(100.00%vs.81.97%)、Pg(100.00%vs.83.61%)、Pm(29.73%vs.4.92%)、Pi(59.46%vs.37.70%)、Pn(78.38%vs.42.62%)、Tf(94.59%vs.55.74%)，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 两组患者龈下菌斑病原菌检出率对比[例(%)]

2.2 两组患者龈下菌斑病原菌数量对比

合并组龈下菌斑Aa、Cr、Pg、Pm、Pi、Pn、Tf病原菌数量高于单纯组(P<0.05)，两组龈下菌斑Fn病原菌数量对比无差异(P>0.05)，见表3。

表3 两组患者龈下菌斑病原菌数量对比

2.3 两组患者HbAlc、FPG水平对比

合并组HbAlc、FPG水平高于单纯组(P<0.05)，见表4。

表4 两组患者HbAlc、FPG水平对比

2.4 龈下菌斑病原菌数量与患者HbAlc、FPG水平的相关性分析

经Pearson分析结果显示，Aa、Cr、Pg、Pm、Pi、Pn、Tf数量与HbAlc水平存在正相关(r=0.523、0.674、0.406、0.514、0.662、0.447、0.470，P<0.05)，Aa、Cr、Pg、Pm、Pi、Pn、Tf数量与FPG水平存在正相关(r=0.679、0.307、0.624、0.450、0.453、0.387、0.695，P<0.05)，见图1。

图1 龈下菌斑病原菌数量与患者HbAlc、FPG水平的相关性分析

3 讨论

牙周炎作为口腔常见疾病之一，患者牙周病原菌及其代谢产物在炎症反应过程中起到重大作用[8-9]。而T2DM与机体代谢紊乱存在密切联系，且近几年来T2DM的患病率在不断提升，年龄偏大的牙周炎患者患病率也呈现出上升趋势，病原菌感染、炎症反应是牙周炎与T2DM相同的病理基础，因此可能存在双向促进关系[10-11]。

牙菌斑是一种细菌性生物膜，龈下菌斑病原菌在牙周炎的发生、发展过程中发挥着重大作用，牙菌斑生物膜为一种复杂性生态群体，有着较为独特的病原菌生理学功能及生物膜结构[12-13]。有相关研究表明，龈下病原菌的聚集存在一定的规律，依据其聚集特点及患者牙周情况，口腔病原菌可按照颜色进行分级，其中Pg、Tf等为红色复合体，在牙周炎的发展过程中息息相关，而橙色第二复合体包括Fn牙周亚种、Pm、Pi、Pn等，也均参与牙周炎的发展[14-15]。龈下病原菌的优势菌主要以革兰阴性厌氧菌，如Cr、Pg、Pi、Tf等，病原菌在患者牙周袋内形成，最后致使牙周炎的发生[16-17]。本研究结果显示，虽两组龈下菌斑Fn病原菌检出率对比无差异(P>0.05)，但其余病原菌检出率高于单纯组Aa(24.32%vs.0.00%)、Cr(100.00%vs.81.97%)、Pg(100.00%vs.83.61%)、Pm(29.73%vs.4.92%)、Pi(59.46%vs.37.70%)、Pn(78.38%vs.42.62%)、Tf(94.59%vs.55.74%)，差异有统计学意义(P<0.05)，说明老年T2DM合并牙周炎患者多数龈下菌斑病原菌检出率更高，提示患者出现T2DM可能与牙周炎存在相互促进作用，这是由于牙周病原菌可从损伤的牙周袋内壁进入机体血液循环或其他器官，进而导致血管发生炎症反应，刺激牙周膜上的成纤维细胞分泌更多的炎症因子，进而通过体循环运送至机体各处，影响患者血糖血脂的正常代谢[18-19]。

孟琳[20]等学者的研究探讨牙周炎合并T2DM患者血清炎性因子、糖脂代谢的变化，结果显示牙周炎伴T2DM患者FPG、空腹胰岛素(Fins)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白介素6(IL-6)水平与PD SBI水平存在正相关(r=0.533、0.574、0.649、0.628、0.594、0.614、0.633、0.671，P<0.05)。而本研究通过检测两组龈下菌斑病原菌数量及HbAlc、FPG水平，探讨牙周病原菌与T2DM的关系，结果显示，合并组龈下菌斑Aa、Cr、Pg、Pm、Pi、Pn、Tf病原菌数量及HbAlc、FPG水平均高于单纯组(P<0.05)，再经Pearson分析结果显示，Aa、Cr、Pg、Pm、Pi、Pn、Tf数量与HbAlc水平存在正相关(r=0.523、0.674、0.406、0.514、0.662、0.447、0.470，P<0.05)，Aa、Cr、Pg、Pm、Pi、Pn、Tf数量与FPG水平存在正相关(r=0.679、0.307、0.624、0.450、0.453、0.387、0.695，P<0.05)，提示老年T2DM合并牙周炎患者龈下菌斑病原菌与其血糖水平存在明显相关性，患者血糖水平越高，其病原菌越多，出现牙周炎的几率就越大。这是由于T2DM为一种先天性免疫性疾病，而炎症反应在该病的发病机制中起着媒介作用，炎症又是牙周炎的启动因子，并可通过胰岛素受体活性的抑制加重牙周炎[21-22]。

综上所述，老年T2DM合并牙周炎患者相较于单纯牙周炎患者具有更高的龈下菌斑病原菌检出率，且多数病原菌数量较高，其病原菌数量与患者血糖水平存在明显相关性，说明血糖水平能影响老年牙周炎患者病原菌情况，为临床诊治提供一定依据。