地衣芽孢杆菌发酵条件优化和抑菌活性测定

张 钰，马 曦，赵金标，鲁 琳

(1.北京农学院动物科学技术学院，北京 102206；2.中国农业大学动物科学技术学院，北京 100193)

抗生素能通过其分子结构识别靶细菌膜表面的结合位点[1]，抑制细菌生长甚至灭杀细菌。畜牧业中使用抗生素虽能提高畜禽的生长性能，但同时也带来许多危害[2-3]。目前，全球畜牧业禁抗已成为趋势，欧盟畜牧业在20世纪末陆续禁用维吉尼亚霉素、螺旋霉素等多种抗生素[4]。但各国畜牧业禁抗后陆续出现畜禽生产性能下降，疾病发生率上升等问题[5-6]。中国农业农村部第194号公告规定自2020年1月1日起，退出除中药外的所有促生长类药物饲料添加剂品种，自2020年7月1日起，饲料生产企业停止生产含有促生长类药物饲料添加剂(中药类除外)的商品饲料。寻找合适的替抗产品对中国畜牧业今后的发展极为重要。

地衣芽孢杆菌作为替代抗生素的饲用益生菌，能分泌纤维素酶、几丁质酶等多种外源酶[7]，可帮助畜禽消化饲料[8]，改善肠道组织结构[9-10]。地衣芽孢杆菌具有广泛的抑菌谱，能抑制致病菌黏附在肠黏膜表面，并通过分泌多种脂肽类抑菌物质来抑制致病菌的生长[11-13]，且对部分真菌及霉菌具有良好的抑制作用[14]。此外，有研究显示，亲缘个体间的肠道菌群存在相似性[15]，地衣芽孢杆菌改变畜禽亲代肠道菌群可能对子代肠道微生物区系造成影响。目前，地衣芽孢杆菌已被欧美多国批准用于畜牧业生产[16-17]。

地衣芽孢杆菌在畜牧业中应用还需探究发酵过程中的各项参数，且不同地衣芽孢杆菌菌株可能携带有不同抗生素抗性基因[18]，需探究其生物安全问题。本研究基于前期筛选得到的1株地衣芽孢杆菌19148，测定其在体外发酵的抑菌活性及适宜的发酵条件，分析其对多种抗菌药的耐药性，以期为下一步利用地衣芽孢杆菌生产畜禽发酵饲料，探究其发挥益生功能的机理机制提供研究依据。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

地衣芽孢杆菌19148(Bacilluslicheniformis19148)由中国农业大学农业农村部饲料工业中心分离和保存[19]；供试致病菌大肠杆菌(EscherichiacoliK88)、鼠伤寒沙门氏菌(SalmonellaTyphimurium)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus1882)均由中国农业大学农业农村部饲料工业中心动物营养国家重点实验室保存。

1.2 培养基

LB培养基、MHA培养基(北京奥博星生物技术有限公司)；药敏纸片(杭州微生物试剂有限公司)。

1.3 地衣芽孢杆菌19148抑菌条件分析

1.3.1 不同pH对地衣芽孢杆菌19148抑菌效果的影响 设置pH 2.0～12.0共11个处理，每个处理3个重复。用1 mmol/L的NaOH和0.5 mmol/L的HCl调整LB液体培养基pH。制备好的培养基用高压灭菌锅灭菌，冷却后用无菌接种环挑取地衣芽孢杆菌19148单菌落接种到100 mL液体培养基中，37 ℃、200 r/min培养24 h。将培养得到的菌液7 500 r/min离心15 min，取上清液，用0.2 μm滤膜过滤制成无菌滤液。另用无菌生理盐水分别将大肠杆菌K88、鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌1882菌液稀释至D600 nm值为0.05，按照1∶50的比例与LB固体培养基混合后，取20 mL倒入培养皿，牛津杯打孔后向孔中加入200 μL无菌滤液，37 ℃恒温培养箱中培养24 h，观察并记录抑菌圈直径。

1.3.2 不同温度对地衣芽孢杆菌19148抑菌效果的影响 设置4、25、37、45和75 ℃共5个处理，每个处理3个重复。将接种后的培养基置于相对应的温度条件下，200 r/min培养24 h。取菌液制备成无菌滤液，以牛津杯抑菌试验检测其抑菌活性。

1.3.3 不同浓度金属离子对地衣芽孢杆菌19148抑菌效果的影响 设置0、1、2、4 mmol/L的铜离子组和镁离子组共8个处理，每个处理3个重复。用硫酸铜和硫酸镁调整LB液体培养基中铜离子和镁离子的浓度，无菌接种环挑取单菌落进行接种，37 ℃、200 r/min培养24 h。取菌液制备成无菌滤液，以牛津杯抑菌试验检测其抑菌活性。

1.4 地衣芽孢杆菌19148体外发酵最适条件探究

用接种环挑取LB固体培养基表面的地衣芽孢杆菌19148单菌落，接种到盛有50 mL LB液体培养基的三角瓶中(100 mL规格)，放入摇床37 ℃、200 r/min培养24 h后作为种子液，后续试验用种子液进行液体接种，并以无菌发酵液的抑菌圈直径为指标，探究地衣芽孢杆菌19148的最适发酵条件。

1.4.1 不同种子液接种量对地衣芽孢杆菌19148体外发酵的影响 设置1%、3%、5%和7%接种量共4个处理，每个处理3个重复。向灭菌后的LB液体培养基中按照种子液体积百分比进行接种，37 ℃、200 r/min发酵24 h，发酵液经离心过滤后制成无菌发酵滤液，以牛津杯抑菌试验检测其抑菌活性。

1.4.2 不同发酵时间对地衣芽孢杆菌19148体外发酵的影响 设置16、20、24、28和32 h共5个处理，每个处理3个重复。将种子液按照1%体积百分比接至LB液体培养基，37 ℃、200 r/min发酵，并在相应的时间点取样，制备成无菌发酵滤液，以牛津杯试验检测其抑菌活性。

1.4.3 不同摇床转速对地衣芽孢杆菌19148体外发酵的影响 设置100、150、200、250和300 r/min共5个处理，每个处理3个重复。LB液体培养基中接种1%种子液，37 ℃发酵24 h后以牛津杯试验检测无菌发酵滤液的抑菌活性。

1.5 地衣芽孢杆菌19148耐药性评价

以麦氏比浊管作为参考标准，用无菌生理盐水将地衣芽孢杆菌19148菌液稀释至0.5麦氏浊度单位(MCF)，菌液浓度约为1.5×108CFU/mL，并用LB培养基作为比对，排除培养基本身颜色对的菌液浊度的干扰。用无菌棉拭子蘸取少量稀释后的菌液涂布于MHA培养基表面，待干燥后将含有不同抗菌药的滤纸片贴附在MHA培养基表面，37 ℃培养24 h，测量并记录抑菌圈直径。无抑菌圈或抑菌圈直径<10 mm为耐药，抑菌圈直径在10～15 mm之间为中介，抑菌圈直径>15 mm为敏感。

1.6 数据统计分析

采用Excel 2010和SPSS 23.0软件对试验数据进行统计分析，对不同处理组间的差异进行单因素方差分析，应用Duncan’s法进行差异显著性检验。P<0.05表示差异显著，0.05

2 结 果

2.1 地衣芽孢杆菌19148抑菌条件分析

2.1.1 不同pH对地衣芽孢杆菌19148抑菌作用的影响 pH为2.0、3.0、4.0、10.0、11.0、12.0处理组地衣芽孢杆菌19148生长受到抑制，菌液较为澄清。pH为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0处理组地衣芽孢杆菌19148有明显的生长迹象，其无菌滤液对金黄色葡萄球菌1882没有抑制效果，对大肠杆菌K88和鼠伤寒沙门氏菌有明显的抑制作用，其中pH 5.0、6.0和7.0处理组的抑菌效果显著高于pH 8.0和9.0处理组(P<0.05)，且3组间无显著差异(P>0.05)(图1)。

大肠杆菌K88组间，不同大写字母表示差异显著(P<0.05)，相同大写字母表示差异不显著(P>0.05)；鼠伤寒沙门氏菌组间，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，相同小写字母表示差异不显著(P>0.05)。下同

2.1.2 不同温度对地衣芽孢杆菌19148抑菌作用的影响 4和75 ℃处理组地衣芽孢杆菌19148生长明显受到抑制，菌液较为澄清；25、37和45 ℃处理组正常生长。37 ℃处理组无菌滤液对沙门氏菌和大肠杆菌K88有抑菌活性(P<0.05)，不抑制金黄色葡萄球菌1882；4、25、45和75 ℃处理组无菌滤液对3种致病菌均无抑菌活性(图2)。

图2 不同温度对地衣芽孢杆菌19148抑菌作用的影响

2.1.3 不同浓度金属离子对地衣芽孢杆菌19148抑菌作用的影响 不同浓度硫酸铜处理组无菌滤液对大肠杆菌K88、沙门氏菌和金黄葡萄球菌1882均没有抑制作用。1、2和4 mmol/L镁离子处理组无菌滤液对大肠杆菌K88的抑菌活性没有显著性差异(P>0.05)，且3组均显著高于0 mmol/L镁离子处理组(P<0.05)。0、1和2 mmol/L镁离子处理组对鼠伤寒沙门氏菌的抑菌活性没有显著性差异(P>0.05)，且3组均显著高于4 mmol/L镁离子处理组(P<0.05)(图3)。

图3 不同浓度镁离子对地衣芽孢杆菌19148抑菌作用的影响

2.2 地衣芽孢杆菌19148体外发酵最适条件探究

2.2.1 不同种子液接种量对地衣芽孢杆菌19148体外发酵的影响 3%和5%接种量处理组无菌滤液对大肠杆菌K88的抑菌活性显著高于1%组和7%组(P<0.05)，且3%和5%组之间无显著差异(P>0.05)，1%、3%和5%接种量处理组无菌滤液对鼠伤寒沙门氏菌的抑菌活性显著性高于7%组(P<0.05)，且3组间没有显著性差异(图4)。

图4 不同种子液接种量对发酵液抑菌作用的影响

2.2.2 不同发酵时间对地衣芽孢杆菌19148体外发酵的影响 28 h处理组无菌滤液对大肠杆菌K88和鼠伤寒沙门氏菌的抑菌效果显著高于20、24和32 h处理组(P>0.05)(图5)。

图5 不同发酵时间对发酵液抑菌作用的影响

2.2.3 不同摇床转速对地衣芽孢杆菌19148体外发酵的影响 150和200 r/min处理组无菌滤液的抑菌效果显著高于100、250和300 r/min处理组(P<0.05)，且两组之间无显著性差异(P>0.05)(图6)。

图6 不同摇床转速对发酵液抑菌作用的影响

2.3 耐药性评价

地衣芽孢杆菌19148对27种抗菌药耐药性检测结果显示，地衣芽孢杆菌19148对青霉素、四环素、头孢他啶、呋喃唑酮和多黏菌素B 5种抗菌药表现出中介，对诺氟沙星、氨苄西林、氯霉素等其他22种抗菌药表现出敏感(表1)。

表1 地衣芽孢杆菌19148 对27种抗菌药的耐药性

3 讨 论

3.1 地衣芽孢杆菌19148抑菌条件分析

饲用益生菌应用于发酵饲料的生产，首先要具备较强的抗逆性。饲用益生菌需要在高温加工、低温冷藏等饲料加工工艺过程中保持益生功能。王芬等[20]利用枯草芽孢杆菌发酵花生粕，发现在36 ℃枯草芽孢杆菌的生物活性最高，且随温度升高或降低，其活性逐渐下降。苗永美等[21]通过单因素试验探究pH对枯草芽孢杆菌抑菌活性的影响，结果显示，当初始pH为5.0时，菌株发酵物的抑菌率最高。王晓洁等[22]探究镁离子浓度对侧孢短芽孢杆菌分泌抗菌脂肽的影响发现，在13.01 g/L镁离子发酵液中抗菌脂肽含量最多。本试验中，地衣芽孢杆菌19148表现出了对外界培养条件良好的耐受性，且菌株抑菌活性的最适培养条件与前人研究一致。

3.2 地衣芽孢杆菌19148体外发酵最适条件探究

饲用益生菌在不同的发酵条件下会产生不同的发酵产物，为降低益生菌发酵饲料的生产成本，需对其发酵培养条件进行优化，从而提高发酵效果和益生能力。李光月等[23]利用响应面试验对枯草芽孢杆菌的发酵工艺进行优化，结果显示，枯草芽孢杆菌在200 r/min的转速下，表面活性素的产量最大。秦楠等[24]探究了1株解淀粉枯草芽孢杆菌的发酵特性，结果表明在接种量3%、发酵13 h时，其无菌发酵滤液的抑菌活性最好。但也有研究指出，枯草芽孢杆菌的最适接种量为1.46%[25]。导致这种差异的主要原因可能是发酵液营养水平及不同芽孢杆菌菌株生长速率的不同。本试验结果显示，在3%接种量、150 r/min发酵28 h时，地衣芽孢杆菌19148抑菌活性最好。

3.3 地衣芽孢杆菌19148耐药性评价

长久以来，细菌间获取和发展一系列抗生素耐药机制一直是益生菌应用于畜禽饲料生产的重要阻碍。益生菌产品想要真正替代畜牧业中促生长类抗生素的使用，不仅自身不能对抗生素表现出耐药性，且不能使肠道病原菌对益生菌发挥抑菌活性的途径产生新的耐药机制。由于地衣芽孢杆菌属细菌的遗传相似度很高，很难用遗传标记物进行鉴定和分类，而这就需要在菌株水平对地衣芽孢杆菌的耐药性进行检测。本研究采用27种不同种类的抗菌药对地衣芽孢杆菌19148的耐药性进行检测，结果显示除了对多黏菌素B、呋喃唑酮、头孢他啶、四环素和青霉素表现为中介外，其余22种抗菌药均为敏感，因此地衣芽孢杆菌19148不具有抗菌药耐药性问题。

4 结 论

地衣芽孢杆菌191418对外界环境具有良好的稳定性，在pH 6.0、温度37 ℃、镁离子浓度为1 mmol/L的培养条件下，其抑菌活性最强。体外发酵过程中，3%种子液接种量、150 r/min发酵28 h是其抑菌活性最适发酵条件。药敏试验结果显示地衣芽孢杆菌对27种不同类型的抗菌药表现为中介或敏感性，不具有耐药性。