2-氨基乙基联苯基硼酸酯对玻璃化冷冻牛成熟卵母细胞发育能力的影响

莫显红，岳凯平，孙丽瑶，李 冰，赵 冰，郭 成，徐振军

(赤峰学院化学与生命科学学院，赤峰 024000)

哺乳动物卵母细胞超低温冷冻保存对于保护动物种质资源、加快优良品种繁育、拯救濒危动物等具有重要意义[1]。然而，玻璃化冷冻卵母细胞发育能力降低，制约了该项技术的扩大应用，提高冷冻效率一直是低温生物学领域研究的热点。Ca2+作为细胞内普遍存在的第二信使，参与调控卵母细胞成熟分裂、激活及早期胚胎发育等过程[2]。但在胁迫条件下，如卵母细胞体外操作和体外培养过程中暴露于高氧环境或使用过氧化氢(H2O2)处理，产生的氧化应激可以引起胞内游离Ca2+([Ca2+]i)浓度异常升高，即钙稳态失衡[3]。研究证实，玻璃化冷冻作为一种应激因素，也会引起卵母细胞[Ca2+]i浓度异常增加，使得皮质颗粒(CG)提前释放、透明带硬化，导致受精率降低[4-6]。然而，玻璃化冷冻引起胞内[Ca2+]i浓度升高的具体机制尚未阐明。

胞内[Ca2+]i浓度升高有2个来源，一个是胞外Ca2+的内流，另一个是胞内钙库Ca2+释放[7]。胞内[Ca2+]i浓度降低也通过这2条途径实现[8]。在小鼠、绵羊、牛的卵母细胞玻璃化冷冻保存中，使用无Ca2+或低Ca2+冷冻保护剂均可提高卵母细胞的存活率和发育能力[9-11]。研究表明，在玻璃化冷冻液中添加钙螯合剂1,2-双(2-氨基苯氧基)-乙烷-N,N,N’,N’-四乙酸(BAPTA)[11]、乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸(EGTA)[12]可降低胞内[Ca2+]i含量，从而显著提高冷冻卵母细胞解冻后的发育能力。研究发现，2-氨基乙基联苯基硼酸酯(2-APB)作为IP3受体(IP3Rs)抑制剂，降低IP3Rs敏感性，可抑制吲哚美辛[13]、顺铂[14]等药物诱导的内质网中Ca2+释放，从而抑制细胞凋亡。薛玉环[15]使用2-APB预处理小鼠卵母细胞后进行冷冻，一定程度上降低了胞内Ca2+浓度，减少细胞损伤，提高卵母细胞的发育能力。本实验室前期试验结果表明，在绵羊卵母细胞体外成熟培养液中添加10 μmol/L 2-APB可有效阻止卵母细胞免受氧化应激损伤，提高了绵羊体外成熟卵母细胞的质量[16]。本研究以无Ca2+玻璃化冷冻液冷冻成熟培养24 h的牛卵母细胞，冷冻前用10 μmol/L 2-APB预处理10 min，检测其对冷冻后卵母细胞成活率和发育能力的影响，以期为探讨冷冻保存导致钙稳态失衡的机制提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 卵巢 试验所用牛卵巢来自河北省廊坊市大厂回族自治县屠宰场，采集的牛卵巢置于含双抗的35 ℃生理盐水中，2～4 h内运回实验室。

1.1.2 主要试剂及仪器 DPBS和胎牛血清(FBS)均购自Gibco公司；2-APB(D9754)、FITC-PNA(L7381)、聚蔗糖(Ficoll 70000)、SOF液、非必需氨基酸(NEAA)、必需氨基酸(EAA)、表皮生长因子(EGF)、牛血清白蛋白(BSA)均购自Sigma公司。体视显微镜(Z61)、荧光显微镜(BX51)均购自Olympus公司；激光共聚焦显微镜(EZ-C1)购自Nikon公司；CO2培养箱(3110)购自Thermo公司。

1.1.3 试剂与溶液配制 ①抽卵液：TCM199+5 mmol/L NaHCO3+10 mmol/L HEPES+10 mmol/L HEPES-Na+0.01 g/L肝素钠+10 mL/L FBS+0.065 g/L青霉素+0.05 g/L链霉素。②成熟培养液：TCM199+10% FBS+0.02 IU/mL FSH+ 0.02 IU/mL LH+1 μg/mL E2+1 mmol/LL-谷氨酰胺+10 ng/mL EGF。③mPBS液：DPBS(Gibco)100 mL，添加0.0036 g丙酮酸钠、0.1 g葡糖糖、0.3 g BSA。④FS液：300 g/L聚蔗糖添加0.5 mol/L蔗糖，经mPBS溶解后配制而成。⑤玻璃化冷冻液(VS)及解冻液(TS)：VS1：基础液为mPBS，含7.5%乙二醇(EG)+7.5%二甲基亚砜(DMSO)+20% FBS；VS2：基础液为FS，含15% EG+15% DMSO+20% FBS；TS1：基础液为mPBS，含1 mol/L蔗糖；TS2：基础液为mPBS，含0.5 mol/L蔗糖；TS3：基础液为mPBS，含0.25 mol/L蔗糖。⑥胚胎发育液：SOF+1% NEAA+1% EAA+10 ng/mL EGF+1 mmol/LL-谷氨酰胺+8 mg/mL BSA。⑦2-APB浓储液：取适量2-APB溶解在甲醇中配成1 000倍浓储，分装，于―20 ℃储存，临用前用成熟培养液稀释至10 μmol/L。

1.2 卵母细胞的采集及成熟培养

用带有18号针头的10 mL注射器(先吸取2 mL抽卵液)抽吸卵巢表面3～8 mm的卵泡，于体视显微镜下挑选包裹3层及以上卵丘颗粒细胞、胞质均匀的卵丘-卵母细胞复合体(COCs)放于体外成熟培养液中，在38.5 ℃、5% CO2、饱和湿度的培养箱中培养24 h。

1.3 卵母细胞玻璃化冷冻-解冻

用0.1%透明质酸酶消化体外成熟培养24 h的COCs脱去卵丘颗粒细胞，得到牛MⅡ卵母细胞，随机分成对照组(直接进行玻璃化冷冻保存)和2-APB组(玻璃化冷冻前用10 μmol/L 2-APB处理10 min)。牛MⅡ卵母细胞在室温条件下采用开放式拉长塑料细管(OPS)法进行玻璃化冷冻。将牛MⅡ卵母细胞(5枚为宜)在VS1液中平衡30 s，移入VS2液中渗透25 s，将牛MⅡ卵母细胞及少量VS2液吸入OPS中，并立即投入液氮。2 d后，将OPS从液氮中取出，迅速将牛MⅡ卵母细胞排至TS1液中。MⅡ卵母细胞在TS1液中平衡1 min后移入TS2液中保持5 min；移入TS3液中保持5 min；将MⅡ卵母细胞移入成熟液中，于38.5 ℃、5% CO2、饱和湿度培养箱中恢复培养2 h。

1.4 检测指标及方法

1.4.1 卵母细胞存活率 统计1.3解冻后0 h及恢复培养2 h时的牛MⅡ卵母细胞的存活率。卵母细胞活力的判定标准：卵母细胞的形态正常，无变形；胞质均匀，没有明显的胞浆溢出与皱缩，透明带与卵黄膜完整可见，卵周隙清晰。在体视显微镜下可见存活卵母细胞的卵黄膜折光性好，胞质呈黑灰色；而死亡卵母细胞没有折光性，胞质呈均质的土黄色。

1.4.2 皮质颗粒分布 取1.3冷冻-解冻恢复培养2 h的对照组及2-APB组牛MⅡ卵母细胞，用0.5%链酶蛋白酶消化去除透明带，用3.7%多聚甲醛室温固定30 min，在封闭液(DPBS+0.3% BSA+ 100 mmol/L 甘氨酸)中洗3次，用0.1% Triton X-100渗透5 min。在封闭液中洗3次，每次5 min，卵母细胞与10 μmol/L FITC-PNA室温下共孵育30 min，在mPBS中洗3次，每次5 min。染色压片后于激光共聚焦显微镜下观察。

1.4.3 卵母细胞活性氧(ROS)和谷胱甘肽(GSH)含量 取1.3冷冻-解冻恢复培养2 h的对照组及2-APB组牛MⅡ卵母细胞，在含有1 mmol/L 2′,7′-DCHFDA的DPBS微滴中孵育20 min，用mPBS洗涤后，于荧光显微镜下观察并拍照，激发光为460 nm。用10 μmol/L Cell Tracker Blue CMF2HC孵育牛MⅡ卵母细胞20 min标记胞内GSH，用mPBS洗涤后，于荧光显微镜下观察并拍照，激发光为370 nm。用EZ-C1软件分析ROS和GSH荧光强度值。

1.4.4 卵母细胞发育能力 取1.3冷冻-解冻恢复培养2 h的对照组及2-APB组牛MⅡ卵母细胞，用成熟24 h未冷冻的卵母细胞作为新鲜对照组(Fresh组)，进行孤雌激活，检测各组卵母细胞的发育能力。将各组卵母细胞放入含有7%乙醇的成熟培养液中激活5 min，再放入2 mmol/L 6-二甲基氨基嘌呤(6-DMAP)液中于38.8 ℃、5% CO2、饱和湿度的培养箱中培养4～6 h。充分洗涤后放入孤雌胚胎发育液中继续培养。孤雌激活当天记为第0天，激活后第2、7 d分别统计卵裂率和囊胚率。

1.5 数据统计分析

用SPSS 16.0 软件进行独立样本t检验和单因素方差分析(One-Way ANOVA)，Duncan氏法进行组间多重比较。结果以平均值±标准误表示。P<0.05表示差异显著。

2 结 果

2.1 2-APB预处理对冷冻-解冻牛卵母细胞存活率的影响

由图1可知，与对照组相比，2-APB组冷冻-解冻后牛卵母细胞解冻后(0 h)和恢复培养2 h的存活率均显著增加(P<0.05)(图1)。

*，差异显著(P<0.05)。图3同

2.2 2-APB对冷冻卵母细胞皮质颗粒分布的影响

由表1、图2可知，与对照组相比，2-APB组皮质颗粒在皮质区的分布比例显著提高(P<0.05)，皮质颗粒在胞质内弥散分布比例显著降低(P<0.05)；皮质颗粒部分释放和完全释放的比例在2组间无显著差异(P>0.05)。

A，皮质区分布：皮质颗粒在质膜下皮质外围呈单层环形；B，部分释放：皮质颗粒在质膜下皮质外围分布，但不连续；C，弥散分布：皮质颗粒聚集成形状不规则的小团，弥散分布在胞质中；D，完全释放：在皮质区几乎观察不到皮质颗粒

表1 各组冷冻卵母细胞皮质颗粒的分布比例

2.3 2-APB对冷冻卵母细胞ROS和GSH含量的影响

由图3可知，与对照组相比，2-APB组胞内ROS水平显著降低(P<0.05)，2-APB组胞质内GSH含量显著升高(P<0.05)。

图3 各组牛卵母细胞内ROS和GSH的相对含量

2.4 2-APB对冷冻后卵母细胞孤雌激活发育能力的影响

由表2可知，与Fresh组相比，对照组卵母细胞孤雌激活胚胎的卵裂率、囊胚率均显著降低(P<0.05)；与对照组相比，2-APB组孤雌激活胚胎的卵裂率和囊胚率均显著提高(P<0.05)，且2-APB组与Fresh组无显著差异(P>0.05)。

表2 各组冷冻卵母细胞孤雌激活的发育潜力

3 讨 论

Ca2+作为第二信使在细胞信号转导过程中发挥重要作用，参与调节许多生命过程，因此细胞内严格的钙稳态调控对维持细胞正常生命活动至关重要。胞内持续的[Ca2+]i浓度升高，可激活磷脂酶、蛋白酶和核酸内切酶，造成细胞生物膜系统、细胞骨架系统及遗传物质系统受损，导致细胞损伤甚至凋亡[17]。研究报道，玻璃化冷冻降低了卵母细胞的存活率和发育能力，这一现象与冷冻过程中低温或抗冻保护剂(如DMSO、EG)引起胞内[Ca2+]i异常升高有关[9]。为了提高冷冻保存效率，研究者去除冷冻液中的Ca2+并加入Ca2+螯合剂BAPTA，降低胞内[Ca2+]i浓度，可显著提高冷冻卵母细胞的发育能力[11,18]，这与本研究结果一致。本试验在不含Ca2+的冷冻液中玻璃化冷冻保存卵母细胞，冷冻前采用2-APB处理可显著提高解冻后的存活率和孤雌胚胎的发育能力。

哺乳动物卵母细胞皮质颗粒的正确分布与卵母细胞质量和后期胚胎发育能力密切相关[19]。研究报道，牛[19]、小鼠[20]、猪[21-22]、绵羊[23]MⅡ期卵母细胞的皮质颗粒在皮质区呈单层环形分布。受精时卵母细胞激活，皮质颗粒内容物从卵母细胞的皮质释放到卵周隙，使皮质颗粒在皮质外围的单层环形分布消失，透明带硬化，对阻止多精入卵具有重要作用[24]。这种使卵母细胞激活、发生皮质反应的机制与胞内[Ca2+]i浓度升高息息相关[25]。研究发现，玻璃化冷冻保存MⅡ期卵母细胞常发生皮质颗粒提前释放的异常现象[26]，导致透明带硬化，影响受精效果[27]。分析其机制发现，玻璃化冷冻液中的DMSO和EG均可引起胞内[Ca2+]i浓度升高，并与受精时[Ca2+]i浓度增加量相当，可以引起皮质反应[28]。研究表明，使用无Ca2+的玻璃化冷冻液可显著降低EG引起的胞内[Ca2+]i增加，但对于DMSO引起的[Ca2+]i浓度升高并无影响[9]，揭示内质网钙库是胞内[Ca2+]i增加的主要原因。内质网IP3R是主要的钙释放通道，对钙稳态维持起核心作用[29]。2-APB作为IP3R抑制剂，可阻断内质网钙库向胞浆释放Ca2+，从而阻止胞内[Ca2+]i浓度异常升高[30]。本试验发现，玻璃化冷冻使卵母细胞皮质颗粒损伤型分布比例显著升高，然而冷冻前用2-APB处理显著提高皮质颗粒的皮质区分布比例。表明2-APB可有效阻断IP3R钙通道从内质网钙库向胞浆中释放Ca2+，与BAPTA螯合效果一致[11]，显著降低胞内[Ca2+]i浓度，阻止皮质颗粒提前释放。

ROS是分子氧在还原过程中的中间产物，具有双重生物学效应。生理剂量的ROS有利于卵母细胞的成熟和发育，而在卵母细胞体外成熟培养过程中，由于氧浓度、机械处理及其他因素的影响，产生大量ROS，导致脂质过氧化而损伤生物膜，抑制蛋白质和酶类的功能，且出现线粒体功能异常、DNA损伤[31]，从而影响卵母细胞质量和胚胎发育能力[32]。研究发现，ROS如过氧化氢或过氧化物可通过改变Ca2+转运通道的功能调节胞内氧化还原状态[33]。研究表明，用H2O2处理人卵母细胞可引起胞内[Ca2+]i浓度短暂升高[34]。另有研究证明，玻璃化冷冻可引起胞内钙稳态失衡，线粒体功能异常，从而产生大量ROS导致细胞氧化损伤[35]。可见，ROS的产生与胞内[Ca2+]i浓度异常升高有关。本试验采用2-APB处理卵母细胞，显著降低了ROS水平，说明2-APB阻断了IP3R钙通道从内质网钙库向胞浆释放Ca2+。此外，GSH作为清除氧自由基的清道夫，在细胞的抗氧化系统中起着重要作用，是卵母细胞成熟的重要标志，对后期胚胎发育至关重要[36]。本研究玻璃化冷冻卵母细胞前用2-APB处理，阻断IP3R钙通道从内质网钙库向胞浆中释放Ca2+可维持钙稳态平衡，显著提高胞内GSH含量，从而提高孤雌激活胚胎发育能力。

4 结 论

本试验结果表明，在无Ca2+玻璃化冷冻液中，冷冻保存前用2-APB处理卵母细胞，可提高卵母细胞的存活率及卵母细胞内GSH含量，降低卵母细胞皮质颗粒损伤型分布比例和胞内ROS含量，从而改善冷冻-解冻后卵母细胞质量及后期胚胎发育能力。