石榴皮多酚的提取、制备及其应用研究进展

张佳浩，李道明，钟小荣，刘宁

（陕西科技大学食品与生物工程学院，陕西 西安 710021）

石榴是一种药食同源的食品，具有重要的应用价值。鲜石榴可食用，酸甜适口；石榴汁可以作为饮品，有美白的功效；石榴籽可提取油脂，提取的油脂富含石榴酸（9c，11t，13c-C18∶3），具有抗氧化、抗炎和抗癌症等功效[1]；石榴皮可作中药，具有涩肠止泻、止血、驱虫等功效[2]。近年来，关于石榴皮成分的研究日渐清晰[3]。研究发现石榴皮中含有丰富的多酚，主要包括黄酮类（以槲皮素为主）和单宁类（以安石榴苷、安石榴林和鞣花酸为主）；此外，还含有有机酸、酚酸、甾体类、萜类、脂肪酸、甘油三酯和生物碱类等[4]。研究表明石榴皮多酚具有良好的抗氧化性，在食品领域有作为天然抗氧剂的应用前景[5-7]。

石榴皮中单宁类（鞣质）种类丰富、含量高；石榴皮单宁多以游离形式存在，大多数为水解单宁和缩合单宁，少数以结合形式存在[8]。石榴皮单宁对水质的要求较高，原因在于石榴皮单宁对水中的金属离子十分敏感（研究表明石榴皮单宁在纯水中的提取量是生活饮用水中的近30倍）[9]。近年来，随着提取技术的进步和发展，从石榴皮中提取多酚的方法日益丰富[10]。但石榴皮成分的复杂性和缺少商业上有价值的标准，使得石榴皮多酚的提取仍然面临许多问题。目前从石榴皮中提取多酚的方法主要集中在乙醇粗提取上[11]，提取后对提取物采用大孔树脂进行富集，可以较大程度上提高多酚纯度，但多酚回收率低，工业应用前景差；此外，由于提取纯化不彻底，导致检测成分数量众多给分离造成困难，并且部分多酚溶解性差的特性也是制约检测方法发展的重要因素。

安石榴苷和鞣花酸为石榴皮多酚中的主要成分[12]，近年来因其在医疗上具有抗炎抑菌、清除自由基[13]、抗肿瘤和抗癌[14]、提高机体免疫力[15]等功效而引起了广泛关注；此外，安石榴苷和鞣花酸在食品行业中具有防止脂质氧化、延缓有毒氧化产物的形成和延长食品保质期等诸多功能[16]。安石榴苷分子量大、性质不稳定，但作为一种水溶性多酚，其提取难度小、易操作；鞣花酸结构简单，化学性质稳定且来源丰富，但是鞣花酸难溶于水或油，目前多采用二甲基亚砜或氯仿溶解提取。就现阶段的研究来说，鞣花酸的提取方法种类多样但是效率低、损耗大、产率低且对环境不友好；而溶解效果差是限制其发展的主要因素。

本文综述了石榴皮多酚中的主要成分安石榴苷和鞣花酸的研究现状，针对石榴皮多酚的纯化检测及其功能性、安石榴苷两种同分异构体转化、鞣花酸的溶解及富集等问题进行介绍，以期为石榴皮多酚提取、检测、改性等研究提供参考。

1 石榴皮多酚提取及应用研究进展

1.1 石榴皮多酚的粗提取

目前，石榴皮多酚的提取主要依靠溶剂与辅助手段（超声波[17-18]、微波[19-20]、超高压[21-22]、酶法[23]、超临界技术[24]等）相结合，利用大多数酚溶于水或甲醇、乙醇、丙酮等有机溶剂进行提取[25-26]。其中甲醇可溶解低分子量的单宁，并能提取出石榴皮中大量的酶，故提取后样品通常需要除掉提取出的酶以防止发生反应[27]，而丙酮则是提取高分子量单宁的首选[28]。大多数有机溶剂提取石榴皮多酚时，所提取出的成分复杂且不利于分析和纯化，同时提取不彻底，仍然存在一定量不能被提取的多酚（主要为结合态多酚）和难溶于水的鞣花酸[29]。部分溶剂对石榴皮多酚表现出优越的溶解性，但存在对人体有害、易燃易爆和分离纯化难度大等问题。通过有机溶剂提取后的粗多酚，会进一步采用大孔树脂分离纯化[30]。但存在吸附和解吸耗时长，并且存在部分多酚无法洗脱等问题。

近年来，低共熔溶剂因其高效的溶解性、可降解性及绿色环保性，在天然产物的提取方面引起了广泛关注[31]。但目前关于其应用于石榴皮多酚提取的研究还未有报道。

1.2 石榴皮多酚的纯化和检测

石榴皮多酚粗提取物的纯化多采用两步纯化的方法，第一步纯化多采用高速逆流色谱；第二步采用色谱柱吸附（多为反相色谱柱）[32]。纯化后极大的提高了石榴皮多酚的纯度，特别是提高了安石榴苷的纯度。现阶段对安石榴苷的纯化已经达到较高水平，如表1所示，安石榴苷纯化可达90%以上。由于安石榴苷存在同分异构体[33-34]，所以目前多采用反相高效液相色谱（reversed-phase high performance liquid chromatography，RP-HPLC）对安石榴苷进行检测[35]，反相高效液相色谱可以对安石榴苷的两种同分异构体进行分离测定[36-37]。此外，研究发现两种安石榴苷在一定比例和pH值下可以相互转化，但其相互转化的具体原因未知[38-39]。

表1 安石榴苷的提取及纯化Table 1 Extraction and purification of punicalagin

1.3 石榴皮多酚的应用研究进展

1.3.1 石榴皮多酚的抗氧化作用

食品行业中，石榴皮多酚的抗氧化性受到了广泛关注，它所代表的是一种或几种天然抗氧化剂。原田等[41]研究发现游离型石榴皮多酚为主要多酚成分，游离态石榴皮多酚抗氧化能力数值是结合态的10倍～20倍，石榴皮的外皮、中皮、内皮抗氧化性差别不大。黄戴纯等[42]利用大孔树脂纯化得到纯度约90%的多酚，在清除 1，1-二苯基-2-苦肼基 (2，2-diphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH)自由基和羟基自由基效果远超粗提物，但是与维生素C相比清除率相差较大。唐远谋等[43]通过比较多酚体外抗氧化作用，以没食子酸和石榴皮纯提物为参照，发现没食子酸、石榴皮粗提物和纯提物对DPPH自由基，羟基自由基和超氧阴离子自由基的清除率存在差异，石榴皮多酚在体外具有较强的抗氧化作用。另一方面研究表明石榴皮多酚的抗氧化性优于2，6-二叔丁基对甲苯酚（2，6-di-tert-butyl-4-methylphenol，BHT）、丁基羟基茴香醚（butylated hydroxyanisole，BHA）等抗氧化剂[44]。谢贞建等[44]在相同的储存时间和添加量下比较了对大豆油氧化的抑制能力，发现抗氧化能力大小顺序为石榴皮提取物＞茶多酚＞BHA＞竹叶提取物＞甘草提取物＞迷迭香提取物＞BHT。由此可知，石榴皮多酚有用于油脂中作为天然的抗氧化剂来代替传统的特丁基对苯二酚（tertbutylhydroquinone，TBHQ）的应用前景。目前研究表明TBHQ对人体存在潜在的风险，欧盟标准中已经禁止在食用油中添加TBHQ。相反，中国和美国等国家仍然把TBHQ作为食用油中的抗氧剂使用。在未来抗氧化剂的研发中，天然抗氧化剂凭借来源天然、可再生、绿色环保等优势必将代替传统的化学合成抗氧化剂。但石榴皮多酚微溶于油脂，因此未来对石榴皮多酚进行改性，在保留其抗氧化能力的同时提高其脂溶性将成为重点研究方向。

1.3.2 石榴皮多酚对脂肪酶的抑制作用

除具有优异的抗氧化性能外，研究发现石榴皮多酚还存在其他重要功能。早在2005年，研究者发现从茶叶中提取的多酚对脂肪酶具有抑制作用，其中没食子酸表现的抑制作用最为突出[45]。先前研究表明胰脂肪酶抑制剂的植物化学物质主要包括皂苷、多酚、黄酮类化合物、萜类和咖啡因[28]。相关专利指出，结合六氢联苯酚基团（hexahydroxydiphe-noy，HHDP）的相关鞣花单宁也有很好的抑制作用，而已知石榴皮多酚中安石榴苷与鞣花酸存在HHDP基团[46]。蒲博等[47]将纯化后的石榴皮多酚作用于脂肪酶，试验结果表明石榴皮多酚对脂肪酶有抑制作用。因而可将多酚添加到中性油脂中，抑制脂肪酶对中性油脂的利用，开发降低肥胖率的相关产品；更重要的是，石榴皮多酚的添加并不会改变油脂风味，所以可以添加到黄油、冰激凌、奶油等产品中，降低人体对脂肪的吸收，使产品更加健康[28]。另外也有研究报道石榴皮多酚会造成油脂颜色加深，其对油脂色泽影响的具体机制尚不明确[45]。

1.3.3 石榴皮多酚对亚硝酸盐的清除和抑菌作用

石榴皮多酚具有清除亚硝酸盐及阻断亚硝胺合成的功效。绿色蔬菜是膳食硝酸盐的重要来源。而硝酸盐和亚硝酸盐可作为防腐剂和着色剂，在食品中有着广泛用途[44]。但亚硝胺盐作为N-亚硝胺的前体物质，对人体的健康会造成威胁。研究发现，石榴皮多酚能够清除亚硝酸盐，且石榴多酚对亚硝胺的阻碍作用随着浓度和时间的增加而增加，在100℃下，均表现出较强的阻断能力[48]。此外，石榴皮多酚也表现出良好的抑菌作用，研究表明当丙酮提取多酚液作用于金黄色葡萄球菌、痢疾杆菌、沙门氏菌和大肠杆菌等微生物时，表现出明显的抑菌作用，其中大肠杆菌的最低抑菌浓度为3.9μmol/mL，痢疾杆菌的最低抑菌浓度为7.8 μmol/mL[49]。

2 安石榴苷

安石榴苷（punicalagin，PC）是石榴皮多酚的成分之一。其作为一种水解单宁，易溶于水，可溶于甲醇、乙醇、乙腈等有机溶剂，其化学性质不稳定，容易在高温或光照下发生分解[50]。实验室主要采用酸水解安石榴苷。安石榴苷的相对分子量为1 083，化学式为C48H28O30，分子结构中含有多个酚羟基，具有良好的抗氧化性。安石榴苷结构中含有1个六氢联苯酚单元、1个gallagyl单元和1个葡萄糖单元[51]。此外，研究发现安石榴苷存在一对同分异构体[47]。石榴皮经提取及纯化，得到的产物中安石榴苷的含量达70%以上，同时安石榴苷在石榴皮多酚中的质量比例最高，可达28.73%，其次为鞣花酸6.23%[35]。

安石榴苷的水解目前的研究主要集中在酸水解，安石榴苷水解可产生一分子鞣花酸和一分子安石榴林，故安石榴苷是鞣花酸的一个重要来源。而安石榴林（punicalin）同样化学性质不稳定，可分解为gallagic。安石榴苷的完全水解产物为鞣花酸与gallagic[52]。安石榴林比安石榴苷少了一个HHDP基团，其分子结构中含有10个酚羟基，同样具有优异的抗氧化能力[50]。研究发现大量服用安石榴苷后，人体血浆中安石榴苷含量不高，在人体循环系统中几乎检测不到安石榴苷的存在，只有痕量的鞣花酸[32]。

3 鞣花酸

鞣花酸（ellagic acid，EA），又名并没食子酸、胡颓子酸，鞣花酸的分子式为C14H6O8，相对分子质量为302。鞣花酸是一种多酚二内脂，分子中亲酯部分有4个环、亲水部分有4个酚羟基以及两个内脂环，正是这些特殊的结构使其水溶性和脂溶性均很低[53]。其微溶于醇，溶于碱、吡啶，不溶于醚。鞣花酸还能与三氯化铁发生显色反应呈蓝色，遇硫酸呈黄色。鞣花酸也易与镁离子等金属阳离子结合[16]。而鞣花酸在多数有机溶剂中表现出的低溶解性，使鞣花酸的分离容易实现。目前酸水解和碱水解为制备鞣花酸的主要方法。石榴皮多酚中鞣花酸的来源多样：游离态的鞣花酸、缩合形式的鞣花单宁、安石榴苷水解以及糖苷等。鞣花酸的来源如图1所示。其中游离态为鞣花酸主要存在方式，鞣花单宁和糖苷相结合的鞣花酸也是游离态鞣花酸的重要来源。

图1 鞣花酸来源Fig.1 Sources of ellagic acid

3.1 鞣花酸的提取

鞣花酸的分离依靠其溶解性，游离的鞣花酸呈油滴状难溶于水，分离相对容易，同时鞣花酸的化学性质稳定，有很高的利用价值。其次对于高纯度鞣花酸检测方法多样、简单，常用的有紫外可见光光度计法和高效液相法[54-57]，具体见表2。

3.2 鞣花酸的制备——酸水解和生物合成法

研究发现鞣花酸的来源主要有游离态和结合态两类[62]。目前研究是通过控制酸水解的条件如酸浓度、反应溶液种类、温度和时间等，来实现鞣花单宁和鞣花苷的水解提高鞣花酸的产量。García-Villalba等[51]在90℃下采用4 mol/L的盐酸溶液水解鞣花单宁，并采用甲醇/二甲基亚砜对其进行二次水解发现，安石榴苷α、安石榴苷β和安石榴林几乎可以达到完全水解，并且鞣花酸的含量可达到260.8 mg/g。同时采用丙酮/水进行初步提取，浓缩后冷冻干燥，再进行酸水解试验，结果发现在纯水中水解的效果优于甲醇（在甲醇中容易产生甲基化衍生物）。由于水解后仍然有大量的鞣花酸与颗粒形成小球体，损失严重，所以研究者利用二甲基亚砜/甲醇对这部分鞣花酸进行溶解，结果表明相比于直接水解，鞣花酸的含量提升了近5倍，同时二甲基亚砜对gallagic表现出不错的提取效果。鞣花酸的水解在4 h就已经达到平衡，但是要得到较完全的水解仍然需要24 h[51]。现阶段主要问题还是水解时间过长。但是对于溶剂中存在的鞣花酸和gallagic的分离仍然很困难。

生物合成法是一种利用微生物如黑曲霉、假丝酵母等真菌以没食子酸为原料，通过酯氧化聚合合成鞣花酸的方法[62]。与化学合成法相似，过程复杂控制难度大且分离困难，反应时间过长，实际应用较为困难。尽管现在仍然处在实验室研究阶段，但是作为一种绿色环保的方法，具有较好的发展前景。此外，微生物的水解酶可以作用于与糖苷结合的鞣花酸，相关研究显示对提取后的残渣利用水解酶处理后，提取得到的鞣花酸含量高于直接提取[61]。

4 安石榴苷的体内代谢及在食品中的应用前景与展望

研究发现，利用大鼠研究安石榴苷在体内的代谢，研究发现大鼠肠道中的肠道微生物首先将安石榴苷分解成鞣花酸，鞣花酸再进一步分解生成分子量更小的尿石素，尿石素随后被大鼠吸收，进而在生物体内发挥重要作用[63-65]。尹培培等[65]阐述了作为鞣花酸代谢产物的尿石素的生物活性，尿石素具有与安石榴苷、鞣花酸相似的生物活性，如抗氧化、抗炎、抗癌等。

有研究报道在我国不同地区种植的石榴，其石榴皮存在差异，表现在安石榴苷和鞣花酸的比例不同，但是两者的含量总和却十分接近[39]。安石榴苷的化学性质不稳定，且分子量大，故其在食品中的应用受到了较大的限制。而来源丰富的鞣花酸性质相当稳定。所以进一步提高鞣花酸的提取效率、纯化效果、减少损失和提高得率成为重要研究方向之一。但是鞣花酸溶解性差，也是其最大的约束条件，所以为拓展其应用领域，对鞣花酸进行改性，在保持其抗氧化性的同时尽可能提高其脂溶性成为一种可行的方案。改性后的鞣花酸在食品中的应用更广泛：首先，改性的鞣花酸“视同天然，功能互补”，可作为食用油中的抗氧化剂；其次，鞣花酸具有抗衰老、清除自由基和提高抵抗力等功能，可用于食品、化妆品和医药等领域产品的开发。

5 结语

石榴皮因含有丰富的多酚及其多酚功能的多样性而备受关注。作为含量最高的安石榴苷结构复杂，化学性质不稳定，应用难度大。鞣花酸的结构简单稳定，成为理想的应用产物。目前鞣花酸尽管来源丰富，但是面临着提取和水解的效率低，溶解纯化难度大等困难。目前还存在没有对石榴皮中多酚检测的标准，制备方法过于单一，食品应用匮乏等诸多的问题。而限制鞣花酸发展的根本原因在于其溶解性。针对此困境，可以采用对鞣花酸的酚羟基进行化学修饰以改善鞣花酸的溶解性，其中利用脂肪酶与长链脂肪酸进行化学修饰是一种绿色环保高效的方法。此外，可采用目前受到青睐的绿色溶剂，如低共熔溶剂作为鞣花酸溶解的新方法。