基于GC-MS结合化学计量学方法鉴定四川郫县豆瓣酱

张蕾蕾，吴剑荣，张洪涛，高敏杰，詹晓北

(江南大学 生物工程学院，江苏 无锡，214122)

郫县豆瓣酱作为中国著名的地理标志产品，具有“口感香辣、酯香浓郁、色泽油亮”的特点[1]。根据豆瓣酱发酵的时间，可将其分为红油郫县豆瓣酱和传统郫县豆瓣酱(特级、一级、二级)。一般来讲，红油郫县豆瓣酱的发酵周期为3～6个月，传统郫县豆瓣酱的发酵周期为6个月～5年。二级豆瓣酱发酵6个月以上，一级豆瓣酱发酵1年以上，特级豆瓣酱在3～5年。红油郫县豆瓣酱与传统郫县豆瓣酱除了发酵周期不同以外，其形态、色泽以及生产方式也有很大区别。红油郫县豆瓣酱形态稀薄，呈半流动状态，色泽红亮油润，生产过程中还添加植物油、香料和防腐剂。传统郫县豆瓣酱的形态黏稠绒实，呈半固态，色泽为红褐色，随着发酵时间的延长颜色也会加深，在生产过程中不另外添加油脂和香料。氨基酸态氮是评价郫县豆瓣酱质量的重要指标之一。随着发酵时间的增加，蛋白酶的持续分解作用使豆瓣酱中氨基酸态氮含量逐渐增加，豆瓣酱品质也因氨基酸态氮含量增加而提升[2]。豆瓣酱在后熟过程中，水解蛋白质产生的氨基与还原糖的羰基发生美拉德反应，赋予长时间发酵豆瓣酱独特的风味与颜色[3]。

由于豆瓣酱要经过长时间日晒夜露的发酵过程，发酵条件、原料选取及环境微生物的差异都对于豆瓣酱最终形成的风味具有重要影响，因此不同产地的豆瓣酱在风味组成上都具有独特之处[2,4-5]。贾洪峰等[6]利用电子鼻对7个不同豆瓣样品进行检测，对获得的数据进行主成分分析和统计质量控制分析，结果发现郫县豆瓣和其他豆瓣样品在气味指纹上存在差异性，但对于造成风味差异的物质并没有进一步的研究，且样本偏少。近年来基于矿物元素、化学组分和挥发性物质的分析方法已经广泛应用于对大米[7-8]、茶叶[9-10]、食醋[11]、白酒[12]等食品产地溯源的研究中。因此，本研究利用顶空固相微萃取(headspace solid phase microextraction, HS-SPME)结合GC-MS对郫县和非郫县产区的传统豆瓣酱和红油豆瓣酱样品的挥发性组成进行检测，构建不同产地豆瓣酱的指纹图谱。结合Fisher判别分析和正交偏最小二乘判别分析(orthogonal partial least squares discriminant analysis, OPLS-DA)研究不同产地的豆瓣酱在香气组成方面的差异，以期能够通过挥发性呈香物质对不同豆瓣酱样品进行产地溯源识别，为郫县豆瓣酱的品质鉴别和产品溯源提供一定的参考价值和借鉴作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料

豆瓣酱，无锡市场。具体样品信息如表1所示。

表1 不同豆瓣酱样品产地信息Table 1 Information on broad bean pastes investigated in this study

1.2 实验仪器与设备

TSQ8000三重四级杆气质联用仪、TG-WAXMS A石英毛细管柱，赛默飞世尔科技有限公司。

1.3 挥发性组分检测与鉴定

1.3.1 SPME法萃取过程

使用三重四级杆气质联用仪检测豆瓣酱中的挥发性组分，准确称取研磨后的豆瓣酱样品5.00 g于15 mL样品瓶中，添加10 μL规格为50 mg/L的2-辛醇作为内标，加盖密封待检。置于60 ℃恒温中预平衡15 min。将CAR/PDMS萃取头插入顶部空间(离样品高度20 mm)萃取30 min，完成后退回萃取头，插入GC-MS进样品口，解吸4 min。

1.3.2 色谱条件

色谱柱为TG-WAXMS A石英毛细管柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm)，进样口温度270 ℃。升温程序：起始柱温40 ℃，保持2 min后，以5 ℃/min升至230 ℃，230 ℃保持8 min。其中载气(He)为恒流模式，流速1.2 mL/min。

1.3.3 质谱条件

以EI为离子源，电子能量和温度分别为70 eV和200 ℃；质谱扫描范围(m/z)为45～400 amu；气相色谱与质谱连接口温度为200 ℃，采用不分流模式。

1.3.4 挥发性化合物鉴定

检出组分的谱图与标准质谱数据库(NIST 2014)比对，结合相同分析条件下正构烷烃标准品的出峰情况计算出各个峰的相对保留指数(retention index，RI)，与文献报道的保留指数进行对比综合定性，当且仅当匹配度大于700(最大值为1 000)的鉴定结果才予以报道；某些具有多环或复杂结构的化合物，仅作试验性的鉴定。

1.4 数据处理

使用Xcalibur软件对GC-MS的结果进行处理，根据峰面积归一化法确定各化合物相对含量。采用SPSS Statistics 26.0对不同豆瓣酱样品进行主成分分析和Fisher判别分析。采用SIMCA 14.0进行OPLS-DA。应用Origin 2020软件进行数据图形化处理。

2 结果与分析

2.1 不同品牌豆瓣酱中挥发性成分分析

为了探究以辣椒和蚕豆为原料的郫县豆瓣酱和非郫县豆瓣酱的区别，一共选取105种豆瓣酱样品，包括郫县地区的24种传统豆瓣酱和30种红油豆瓣酱，非郫县地区的33种传统豆瓣酱和18种红油豆瓣酱。将所有豆瓣酱样品的色谱峰面积归一化后，以相对峰面积>0.1%为限定值挑选用于判别分析的风味化合物，筛选结果见表2，一共筛选到87种风味化合物，图1为各样本中挥发性物质相对含量归一化后绘制的热图。

图1 105种豆瓣酱样品中的87种挥发性物质相对含量热图Fig.1 Heat map of relative content of 87 volatile substances in 105 kinds of broad bean paste samples

表2 105种豆瓣酱样品中的87种挥发性物质Table 2 Eighty-seven volatile compounds in 105 broad bean paste samples

酯类主要为山梨酸乙酯、棕榈酸乙酯、月桂酸乙酯、十四酸乙酯等27种物质。在豆瓣酱样品中，酯类化合物的检出种类是最多的。酯类即使在很低的浓度条件下也对食品的香味起着非常重要的作用。山梨酸乙酯的平均相对含量最高(5.02%)，这是因为豆瓣酱中添加了食品添加剂山梨酸钾，造成山梨酸乙酯相对含量较高，但是山梨酸乙酯是一种被国际公认的低毒高效食品防腐剂，可以防止豆瓣酱腐败变质。月桂酸乙酯、十四酸乙酯和棕榈酸乙酯的平均相对含量为1.19%～2.58%，分别为豆瓣酱贡献花果香、椰子香和奶油香气。这3种酯类物质在郫县产区传统豆瓣酱中的平均相对含量明显比非郫县产区高，可能是郫县产区豆瓣酱重要的标志性物质。

醇类主要为乙醇、 β-苯乙醇、芳樟醇等18种物质。醇类是酯化反应的重要前体，也是构成郫县豆瓣特征风味的一类重要化合物，通常呈现出令人愉快的香味及甜味，比如β-苯乙醇具有花果香；芳樟醇具有甜嫩新鲜的花香，似铃兰香气。乙醇是豆瓣酱中含量最高的醇类物质，平均相对含量为21.46%，但在不同产地之间没有明显区别。β-苯乙醇在郫县产区豆瓣酱之间有明显差异，郫县产区的传统豆瓣酱和红油豆瓣酱中β-苯乙醇平均相对含量分别为5.07%和0.92%。

醛类主要为苯乙醛、2-甲基丁醛等12种物质。酮类主要为丙酮、香叶基丙酮等6种物质。醛类和酮类都是羰基类化合物，它们均属不稳定的中间体化合物，易被还原成相应的醇[13]。醛酮类物质主要经过脂质氧化产生，也可能是用于豆瓣发酵的微生物的生长代谢产物，主要以花果香贡献于郫县豆瓣的风味。醛酮类物质在豆瓣酱中的含量比醇类和酯类低。苯乙醛是醛类物质中平均相对含量最高的(1.33%)，郫县产区红油豆瓣酱苯乙醛的平均相对含量比非郫县产区红油豆瓣酱的高，但在不同产地的传统豆瓣酱中的区别不大。酮类物质的相对含量都较低，丙酮是酮类物质中相对含量最高的物质，其最大的相对含量仅为0.88%。郫县产区豆瓣酱的香叶基丙酮的平均相对含量为0.19%，而非郫县产区豆瓣酱的香叶基丙酮的平均相对含量仅为0.04%，香叶基丙酮有可能是郫县产区豆瓣酱的标志性物质。

酸类主要为山梨酸、苯甲酸等6种物质。大多数豆瓣酱中会添加山梨酸钾作为防腐剂使山梨酸的相对含量偏高(2.53%～47.98%)，其中传统豆瓣酱的山梨酸含量相对较低，为2.53%～21.66%，红油豆瓣酱的山梨酸含量相对较高，为19.86%～47.98%。苯甲酸的平均相对含量仅次于山梨酸，达到5.58%。郫县产区的红油豆瓣酱中苯甲酸的平均相对含量较高(9.42%)，其他豆瓣酱样品中苯甲酸的相对含量比较相近。

4种酚类物质中，4-乙基-2-甲氧基苯酚和4-乙基-苯酚的平均相对含量较高，分别为2.00%和1.17%。郫县产区传统豆瓣酱中这2种酚类物质的平均相对含量达到4.36%和2.71%，明显高于其他豆瓣酱。4-乙基-2-甲氧基苯酚具有典型的酱香和烟熏气味，也被鉴定是酱油香气的主要成分之一；4-乙基-苯酚具有木质香、酚香和甜香，可以认为它们是赋予郫县豆瓣特征风味的代表性化合物之一。多项研究表明这2种酚类物质是郫县豆瓣酱的主体挥发性成分[2,14-15]。

烯类为D-柠檬烯和α-姜烯等5种物质。D-柠檬烯具有柠檬果香及新鲜橙子的香气，同时具有消炎、预防和治疗癌症的作用[16]。D-柠檬烯主要存在于郫县产区的红油豆瓣酱和非郫县产区的传统豆瓣酱中，前者的最高相对含量达到13.92%，后者的最高相对含量达到8.15%。部分非郫县产区的传统豆瓣酱添加生姜作为辅料，α-姜烯是生姜中主要活性成分之一，具有鲜花的香气特征，同时具有抗病毒、抗氧化的特性[17]。生姜的添加使α-姜烯的含量也较高，最高相对含量达到20.10%。

杂环类为2-乙酰基吡咯、2,3,5,6-四甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪和2,5-二甲基吡嗪。2-乙酰基吡咯的平均相对含量最高(1.03%)，其余3种杂环类物质最高的相对含量均在0.60%左右。豆瓣酱中鉴定的杂环类物质主要是吡嗪类化合物。吡嗪类物质一般具有烤香、坚果香，主要在后发酵过程中由Maillard反应和Strecker降解产生的氨基酮经缩合反应生成[18]。罗静等[19]发现2-乙酰基吡咯是郫县豆瓣中相对含量最高的杂环类物质，与本研究结果一致。2-乙酰基吡咯可能是豆瓣酱所用辣椒原料中含有的[4,20]。除此之外，王雪梅等[4]在生产豆瓣酱的5种辣椒原料中还检测到2,5-二甲基吡嗪，为郫县豆瓣酱提供酱香味。

2.2 基于OPLS-DA方法的豆瓣酱产地区分模型

图2为OPLS-DA模型得分散点图。可以看出各个产区样品群体内有明显的聚集趋势，仅有2个非郫县红油样本完全落在Hotelline’T2椭圆图外，4种类型豆瓣酱样品均较好的分离。

图2 OPLS-DA 模型得分散点图Fig.2 OPLS-DA scoring plot

载荷图表示各指标与不同产区不同工艺的相关性大小，即图中X变量与Y变量越靠近，其相关性越高。如图3所示，异丁醛(C2)和2-乙基吡咯(C71)与FC的相关性较高；十四酸乙酯(C74)和月桂酸乙酯(C63)与PC的相关性较高；山梨酸乙酯(C40)与FH的相关性较高；甲醇(C6)与PH的相关性较高。

图3 OPLS-DA模型载荷散点图Fig.3 Loading plot of OPLS-DA model

变量权重系数(variable importance for the projection, VIP)值可以量化由OPLS-DA的每个变量对样品分类的贡献，VIP>1的变量被认为是贡献较大的变量。如图4所示，45个变量的VIP>1(图4中前45种物质)，VIP值越大，变量对分类的贡献度越高。其中变量对分类贡献最高的5种物质依次为月桂酸乙酯(C63)、十四酸乙酯(C74)、香叶基丙酮(C65)、9-十六烯酸乙酯(C82)和二氢猕猴桃内酯(C83)。

图4 VIP得分图Fig.4 VIP scoring plot

运用统计推断分析进一步验证鉴别模型，图5-a为OPLS-DA模型置换验证图。Q2代表累积交叉有效性，Q2值越大表示模型可预测度越高；R2代表累积方差值，R2值越大表示模型解释能力越强。图5-a中R2和Q2的截距分别为0.259和-0.326，位于左边绿色的R2值和蓝色的Q2值均低于最右边的值，且Q2的回归线截距为负值，说明建立的OPLS-DA模型没有出现过拟合现象，具有较好的预测能力，可用于后续特征挥发性物质的确定。利用建立的模型对验证集样品进行原产地判别，具体结果见图5-b。验证集中的98～103号样本都实现了准确的预测(共8个样品，75%预测准确)，其中仅104和105号样品预测不准确(共8个样品，25%预测不准确)，尤其是105号样品偏差过大，可能是因为该豆瓣酱样品具有明显的重庆地理风味特征，与其他样品差异过大，使结果无法准确预测，后续会通过其他判别方法进一步分析。

a-置换验证图；b-预测图图5 OPLS-DA 模型置换验证图和模型预测图Fig.5 OPLS-DA permutation test and prediction

2.3 基于Fisher判别分析方法的豆瓣酱产地判别模型

Fisher判别分析能够实现最大的类间距离以及最小的类内距离，使得样本有最佳的可分离性。由于非郫县产区豆瓣酱样品来源于不同产地，为了解决非郫县产区豆瓣酱样品之间差异性过大的问题，本研究进一步建立基于Fisher判别函数的一般判别方法对豆瓣酱样品进行多变量判别分析。

将OPLS-DA筛选出的对原产地判别有重要贡献作用的45种挥发性物质作为判别分析的自变量，对训练集样本进行逐步判别分析，结果显示，乙醛(C1)、甲醇(C6)等15种挥发性物质对豆瓣酱产地判别显著的物质被引入到判别模型中。不同产地和工艺豆瓣酱判别函数模型系数见表3，判别分类结果见表4。

表3 不同产地和工艺豆瓣酱判别函数模型系数Table 3 Discriminant function model coefficients of different broad bean pastes

表4 不同产地和工艺豆瓣酱的一般判别分析结果Table 4 General discriminant analysis of different broad bean pastes

提取模型前3个典型判别函数，Willks’ Lambda检验结果进一步证实，在α=0.05的显著性水平下，3个函数对分类效果均为显著，其中判别函数1、判别函数2和判别函数3累积解释判别模型能力为100%，且典型相关系数分别为0.935、0.853和0.748，表明3个判别函数对豆瓣酱的产地和工艺分类具有重要作用。图6为3个判别函数3的得分值散点图。利用Fisher判别模型对所有训练集样品建立分类模型。在判别模型中FC的31个样品均实现正确的判别；PC有1个样本被误判为PH；FH有2个样本被误判为PH；PH有1个样本被误判为FC。本研究建立的判别模型整体正确判别率为95.9%。为了进一步考查Fisher判别模型的有效性和正确性，用建立的模型对训练集中8个未参加建模的样品进行判别分析，判别结果见表5，其中8个样品均实现正确判别，表明基于挥发性成分的指纹差异可以有效鉴别郫县产区与非郫县产区的豆瓣酱。

图6 不同产区和工艺豆瓣酱前3个典型判别函数得分散点图Fig.6 Scores of the first three typical discrimination functions of broad bean pastes

表5 Fisher判别分析预测结果Table 5 Prediction by Fisher model

3 结论与讨论

本实验利用HS-SPME-GC-MS技术对不同产地来源的豆瓣酱的挥发性成分进行检测与分析，共检测到87种香气物质。基于OPLS-DA建立的判别模型筛选出VIP>1的45种对郫县豆瓣酱的产地判别具有较大贡献的挥发性物质(图4中前45中化合物)。进一步基于筛选出来的45种挥发性物质，利用Fisher判别分析构建产地判别模型，确定15种郫县豆瓣酱的有效溯源指标，其中包含6种酯类、3种醇类、2种酸类、2种酮类、1种醛类和1种酚类。酯类和酚类物质与前人的研究具有一定的相似性。刘超兰等[21]发现豆瓣酱陈酿8个月后十四烷酸、棕榈酸和反式-4-葵烯酸等乙酯衍生物等主体酯香成倍增加。刘平等[22]采用气相色谱-嗅觉测量法及香气活性值法初步确定4-乙基-2-甲氧基苯酚、十六酸乙酯等7种香气化合物为一级传统郫县豆瓣酱的特征香气物质。李治华等[15]发现4-乙基-2-甲氧基苯酚和水杨酸甲酯在不同发酵时间豆瓣酱之间具有明显差异。这表明本文筛选出来的酯类和酚类物质作为有效溯源指标具有一定的代表性。除此之外，香叶基丙酮、3-羟基丁酮等8种物质也是郫县豆瓣酱区别于其他豆瓣酱的重要成分。香叶基丙酮是具有木兰香气的风味物质，略带甜蜜的玫瑰香韵味，郫县产区豆瓣酱中香叶基丙酮的含量高于非郫县产区。3-羟基丁酮具有令人愉快的奶油香味，其仅在非郫县产区的红油豆瓣酱中平均相对含量较高(0.18%)。

Fisher判别分析方法构建的判别模型的整体正确判别率为95.9%，对验证集样品实现了100%的正确判别。在Fisher判别模型中对非郫县产区的红油豆瓣酱的误判率较高，可能是因为不同产地红油豆瓣酱的原料相似度较高，红油豆瓣酱样本量较少也是影响判别模型准确率的因素之一。Fisher判别模型对验证集的判别比OPLS-DA模型更准确，可能是因为在Fisher判别分析中进一步筛选了对原产地分类有重要贡献作用的变量，从而排除了干扰原产地判别的变量，说明变量的选择对判别分析的准确率影响较大。基于OPLS-DA和Fisher判别分析所构建的模型对于郫县豆瓣酱原产地识别有一定的预测能力，对郫县豆瓣酱地理标志性产品及消费者合法权益的保护提供了一定的技术支撑。