一株葡萄白腐病拮抗放线菌的筛选及鉴定

马 光，苏长青，高小宽，吕亚慈，李会芬

（衡水学院生命科学系 河北衡水 053000）

葡萄白腐病是一种常见病害，在世界范围内均有发生。我国各葡萄产区也有发现，而且近年来此病害发生更加普遍。葡萄白腐病早期症状表现为果实上的棕色圆形腐烂病变，随着病情的发展，腐烂区逐渐扩大，最后使果实完全腐烂失去商品价值。在潮湿的条件下，在病变上形成黑色子实体和白色分生孢子。葡萄白腐病是由半知菌亚门垫壳孢属Petr. & Syd 引起的[1]。传统的葡萄白腐病防治是在加强田间管理的基础上进行化学药剂防治。随着环保观念的深入人心，无公害生物农药在葡萄生产中的应用呈逐年上升趋势。本文通过拮抗性筛选，获得了一株对葡萄白腐病具有良好拮抗作用和防治效果的放线菌菌株K5，并通过形态学和16S rDNA 的方法对其分类进行了鉴定，为葡萄白腐病的生物防治提供了优良的微生物种质资源。

1 材料与方法

1.1 土壤放线菌的分离 锥形瓶中加入90 mL 无菌水和取自葡萄园的土壤10 g，120 r/min 振荡25 min后室温静置10 min。取上清1 mL 加入无菌水9 mL。梯度稀释分别制备成1/100，1/1000，1/10000，1/100000 不同浓度的稀释液。取0.1 mL 不同浓度的稀释液均匀涂布到固体高氏一号的培养基表面。28 ℃培养5 d 后挑取没有染菌，单个形态不同菌落接种至试管斜面放入培养箱28 ℃进行培养。

1.2 拮抗放线菌的筛选 挑选试管里长势良好、无污染、形态各异的菌种分别和实验室保存的葡萄白腐病菌种一起在PDA 培养基上相距2 cm 左右划线，将培养皿放到恒温培养箱中28 ℃倒置培养。5 d 后测量葡萄白腐病菌的直径大小，计算抑菌率，具体计算方法见参考文献[2]。

1.3 拮抗放线菌防治葡萄白腐病的离体果试验 选取成熟度和大小一致的巨峰葡萄果实，每处理选10 颗葡萄果实。处理1：喷发酵原液50 倍稀释液，24 h 后再刺伤接种葡萄白腐病菌；处理2：刺伤接种白腐病菌24 h后再喷发酵原液50 倍稀释液；对照：果实喷无菌水。28 ℃条件下保湿3 d 后调查病情指数，计算方法见参考文献[3]。

1.4 拮抗放线菌株的鉴定 根据菌落特征和16S rDNA 鉴定。提取放线菌基因组总DNA，以总DNA为模板，采用通用引物27F 和1492R（序列分别为5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′ 和 5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）扩增其16S rDNA。94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸120 s，35 个循环，72 ℃延伸10 min 一个循环，4 ℃保存。PCR产物纯化后测序，将测定结果进行在线Blastn比对，比对库选择16S rRNA，比对结果以系统发育树的形式进行展示，确定与所筛选菌株分支最近的物种以最终确定所筛选到的放线菌菌株的种属。

2 结果与分析

2.1 平板对峙法筛选拮抗葡萄白腐病的放线菌 利用稀释平板分离的方法获得了9 株放线菌，分别编号为K1-K9，将其与葡萄白腐病病菌一起培养进行平板对峙试验。计算抑菌率表明K5 对葡萄白腐病菌有很强抑制作用，其抑菌率达到了62.56%，显著高于其他8 株（图1）。培养皿内K5 产生了明显的抑菌带，在K5 附近葡萄白腐病菌菌丝不能生长。

图1 放线菌拮抗葡萄白腐病的平板对峙培养抑菌率

2.2 拮抗放线菌对离体果葡萄白腐病的防治效果从表1 可以看出，处理1 葡萄果实的病情指数总体小于处理2，从相对防效来看，处理1 也好于处理2。从不同拮抗菌株来看，平板对峙试验中对葡萄白腐病菌抑制作用较强的防线菌株K5 相对防效最好，显著好于其它8 株放线菌。

表1 放线菌防治离体果葡萄白腐病效果

2.3 拮抗放线菌菌株K5 的鉴定 对葡萄白腐病菌抑制作用最强的菌株K5 菌落特征为：菌落小而致密，菌丝致密微小。刚开始生长时，菌体呈较干而且不透明的状态，颜色为单一的白色，边缘整齐且表面光滑，黏着性强、用接种针很难挑起。而后，逐渐生长成为绒毛状、表面起粉、色泽逐渐丰富。在培养基上可裂生大量分生孢子进行散播、繁殖。初步判定为链霉菌。

以放线菌16s rDNA 通用引物和筛选得到的菌株K5 总DNA分别作为引物和模板进行PCR扩增反应。得到单一扩增条带，将测序结果在NCBI 16s rRNA 数据中进行比对，比对结果的系统发育树表明K5 与淡紫灰链霉菌聚为一支（图2）。结合菌株K5 的形态学鉴定将菌株K5 鉴定为链霉菌，可确定筛选到的拮抗放线菌菌株K5 为淡紫灰链霉菌。

图2 K5 菌株16S rDNA 的系统发育树

3 结论与讨论

筛选对葡萄白腐病具有显著拮抗作用的菌株，研制生物农药也越来越受到重视。拮抗菌株的筛选以及生物农药在葡萄上的应用已经多有报道，解淀粉芽孢杆菌、放线菌[4]等对葡萄霜霉病病菌有拮抗作用。在对葡萄灰霉病的研究中发现假丝酵母菌（对红提葡萄灰霉病具有明显的抑制作用[5]。在葡萄白腐病的拮抗菌株筛选研究中也发现了几种有较强抑菌作用的菌株[6-7]，但数量还相对较少。本研究通过形态学和16S rDNA分类对葡萄园土壤中分离到的1 株对葡萄白腐病菌具有较好抑菌效果的菌株进行了鉴定，确定其为淡紫灰链霉菌，丰富了葡萄白腐病生物防治的微生物菌种资源。为使该菌株能够真正在葡萄生产中得到应用，应继续对其抑菌机理、发酵条件以及生物药剂配方进行进一步深入研究。