甲状旁腺激素对绝经后骨质疏松大鼠骨密度和骨生物力学的影响

叶维建 李国山 黄建芳

(1莆田学院基础医学部，福建 莆田 351100；2国控医疗涵江医院骨科；3莆田市第一医院影像科)

绝经后骨质疏松(PMOP)是指绝经后中老年妇女卵巢功能衰退，雌激素分泌下降，骨形成减少，骨吸收增强，骨代谢失衡，出现的以骨量减少、骨强度降低、骨微结构退行性改变、骨脆性增加、易于骨折为特征的一种代谢性骨疾病，又称高转换型骨质疏松〔1，2〕。雌激素缺乏是PMOP的主要原因，雌激素替代疗法(ERT)已被证实能有效预防PMOP的发生，但长期应用ERT也引发了一些不良反应〔3〕。甲状旁腺激素(PTH)作为调节钙、磷代谢水平的生物活性物质，可调节骨的合成和分解代谢，对成骨细胞和破骨细胞的分化、成熟、凋亡发挥重要作用〔4〕。而PTH防治PMOP以其安全、毒副作用小、全身整体调节等特点，在治疗上有较大优势。本研究探讨PTH对PMOP大鼠骨密度(BMD)及骨生物力学的影响及其潜在的作用机制。

1 材料与方法

1.1实验动物 健康SPF级雌性Wistar大鼠58只，16周龄，未孕，体重(250±20)g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司(许可证号：SCXK(京)2014-0004)，所有大鼠饲养于福建医科大学通风良好的SPF级动物房，同等条件常规喂养：1～2只/笼，温度(22±2)℃，湿度(55±5)%，光照明暗各12 h/d，自由取食和饮水。

1.2实验试剂 重组人PTH1-34(100 μg/支，批号：J201708072，美国Sigma公司)，骨化三醇软胶囊(盖三淳，0.25 μg×10粒，生产批号：1800621，正大制药青岛有限公司)。Lunari DXA型双能X射线BMD检测仪(美国GE公司)，多功能自动染色机和全自动组织脱水机(德国Leica公司)，便携式电子天平NVC4201E〔奥豪斯仪器(上海)有限公司〕，微机控制电子万能试验机(中国瑞格尔公司)。

1.3制备PMOP大鼠模型 大鼠适应性饲喂1 w后，禁食12 h，造模组、骨化三醇组和PTH组均参考“双侧卵巢摘除术”构造PMOP大鼠模型〔5〕。术后青霉素5万U/d预防感染，持续治疗3 d，1 w后拆线。对照组不切除卵巢，而是在卵巢周围切除等量脂肪组织，其他操作步骤相同。

1.4分组及药物处理 术后8 w评价造模成功率，评价标准：BMD峰值减少≥2.5标准差(SD)。3只大鼠因手术感染先后死亡，大鼠造模成功48只(83%)。确认骨质疏松造模成功后按体重随机分为对照组、造模组、骨化三醇组和PTH组各12只。于第2天给予不同药物干预处理，对照组和造模组：皮下注射生理盐水5 ml/kg，1次/d；骨化三醇组：骨化三醇0.25 μg，口服，1次/d；PTH组：皮下注射PTH1-34 50 μg/kg，连续给药6 w。

1.5标本取材 药物干预结束后，测量体重后所有大鼠统一处死，根据大鼠解剖位置准确解剖迅速分离腰椎(L1～6)及双侧股骨，剔除剥离干净附着结缔组织，将两侧股骨和腰椎骨摘出，生理盐水冲洗，称重后用生理盐水浸湿的纱布包裹并标号，装入密闭试剂盒中，放置于-20℃保存，待用于测量BMD、骨矿物质含量(BMC)及骨生物力学指标。另取部分腰椎体(L4)4%多聚甲醛固定24 h，15%乙二胺四乙酸(EDTA)脱钙14 d，采用全自动组织脱水机脱水，透明浸蜡，石蜡包埋，制备石蜡切片(5 μm)，60℃烤箱4 h，保存备用。

1.6测量各组体重和股骨重量 实验前及实验结束分别测量各组体重变化，取各组剔除剥离干净大鼠左侧股骨和腰椎骨(L3)，采用NVC4201E型电子天平称重(1/10万)。

1.7检测各组股骨和腰椎BMD和BMC 取出右侧股骨和腰椎骨(L4)，将其于室温下自然解冻，将右侧股骨腰椎骨(L4)分别做好标记并整齐排列在有机玻璃板上，开启BMD仪器，选定扫描区域，小物体Discovery Wi扫描模式，设置扫描参数：扫描速度60 mm/s，扫描间距1.0 mm×1.0 mm，精密度为1.5%。测定完毕后，将上述骨组织置于搪瓷盘中，放入60℃烤箱24 h，烘烤至恒质量后称量，放置灰化炉中，650℃下灰化36 h，取出灰分称量，应用软件及公式进行分析计算，获取BMD(g/cm2)和BMC值(g)。

1.8检测各组骨生物力学指标 取出右侧股骨和腰椎骨，将其室温自然解冻，检测前显微镜观察骨标本，以确保所有测试标本骨皮质完好没有微小的裂痕、裂缝，完好无损，以保证检测结果的准确性。分别采用三点弯曲法和腰椎压缩试验测定大鼠右侧股骨腰椎(L1)骨生物力学指标，计算机软件根据有压力传感器，探头下降距离与载荷数据计算出记录载荷-位移曲线，依据载荷-位移曲线计算最大载荷(N)、最大应力(Mpa)、抗弯刚度(N·m2)。

1.9观察各组骨组织形态学 取出石蜡切片，参照HE染色法操作步骤进行操作，采用多功能自动染色机进行苏木素-伊红(HE)染色，光学显微镜下观察腰椎骨组织形态学改变。

1.10统计学分析 采用SPSS17.0软件进行单因素方差分析、SNK-q法。

2 结 果

2.1各组体重和骨重量比较 造模组体重较对照组显著增加，而股骨和腰椎骨重量较对照组显著降低(P<0.05)；骨化三醇组和PTH组体重较造模组下降，股骨和腰椎骨重量较造模组均增加，但仅PTH组与造模组差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

2.2各组骨组织BMD和BMC比较 造模组股骨和腰椎骨BMD和BMC较对照组显著降低(P<0.05)，骨化三醇组和PTH组股骨和腰椎骨BMD和BMC较造模组均增加，但仅PTH组与造模组差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

2.3各组骨组织生物力学性能比较 造模组股骨和腰椎骨最大载荷、最大应力、抗弯刚度较对照组显著降低(P<0.05)，骨化三醇组、PTH组股骨和腰椎骨最大载荷、最大应力、抗弯刚度较造模组均增加，但仅PTH组与造模组差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

2.4各组骨形态学变化 对照组骨皮质结构致密，骨小梁饱满粗大，形态结构完整，排列密集有序，未见吸收或断裂现象。造模组骨皮质明显变薄，骨小梁稀疏变薄，部分断裂，结构排列紊乱，髓腔扩大，可见部分空缺骨陷窝。骨化三醇组骨皮质变厚，骨小梁较前稍增多增厚，少量骨小梁断裂，排列尚规则，少量空缺骨陷窝。PTH组骨皮质结构较完整，骨小梁明显增多，致密均匀粗壮，紧密连接成网状，间隙小，骨髓腔变小。见图1。

表1 各组体重和骨重量及骨组织BMD和BMC比较

表2 各组股骨及腰椎骨生物力学指标

图1 各组腰椎骨组织形态学(HE染色，×40)

3 讨 论

PMOP的发病与内分泌、体质、遗传、生活方式等多种因素有关，卵巢衰竭所致雌激素分泌不足是其公认的主要发病原因〔1〕。ERT曾被认为是治疗PMOP的首选方案，但其不良反应突出，长期应用可增加乳腺癌、子宫内膜癌、血栓栓塞性等疾病的危险性，限制了ERT临床上治疗PMOP〔6〕。PTH可调节骨的合成和分解代谢，在维持骨稳态的过程中发挥着双重调节作用，不仅可增加成骨细胞数量，促进骨生长因子释放，增加骨量及BMD，促进骨形成，而且可增强破骨细胞活性，促进骨吸收，同时还可诱导成骨细胞分化，促进胶原合成和骨组织矿化，且可抑制成骨细胞的凋亡〔7，8〕。BMD指单位骨组织单位面积或体积内矿物质的含量〔9〕。BMC指单位骨组织内骨矿盐的含量〔10〕。BMD和BMC是目前临床诊断骨质疏松一项主要“金标准”。骨强度是指骨骼对抗外力作用的能力，主要通过BMD和骨质量两个重要因素所决定，而骨质量又与骨微结构、骨矿含量、骨胶原成分、骨组织形态学、基质的矿化、骨转换、骨生物力学性能及其他等方面因素密切相关〔11〕。大量研究结果表明，单纯BMD和BMC增加，并不一定会增加骨质量，有时反而降低，还需要结合骨生物力学性能指标的变化，其可更好地体现骨强度及抵抗外力的能力〔12〕。骨生物力学性能是研究骨骼在外力作用下的力学特性及受力后的生物效应，是全面评价骨质量的最可靠指标〔13〕。最大载荷、最大应力和结构刚度等指标常用于反映骨的生物力学特性。同时骨组织形态学的变化，也能直观反映骨小梁、骨细胞和骨髓腔的情况，而且能从病理学诠释PMOP骨改变。本研究研究结果表明大鼠PMOP造模后BMD、骨量、骨生物力学性能、骨组织形态和微细结构均发生不同程度的损害，证实了该模型的成功。PTH处理后大鼠体重和骨重量、骨组织BMD和BMC、骨生物力学指标和骨组织形态均得到显著改善，证实了PTH防治PMOP效果。说明PTH能增强骨的生物力学性能，提高BMD和BMC，从而能减少PMOP并发症的发生，其提高骨质量的机制在于改变了骨的显微结构，提高骨胶原纤维及胶原的矿化程度，同时也增加了大鼠体重和骨量，能有效防治PMOP和起到骨保护作用。同时，矫杰等〔14〕研究人PTH片段1～34能增加去卵巢骨质疏松大鼠生化指标、BMD和骨生物力学特性。徐进等〔15〕研究发现人PTH相关蛋白氨基端肽能改善去卵巢骨质疏松大鼠骨代谢，提高BMD和骨生物力学性能。Meta分析结果显示PTH能提高PMOP BMD，降低骨折的风险，且疗效优于阿伦磷酸盐，尤其适用于骨量严重低下和有骨质疏松性骨折的绝经后女性〔16〕。