银胶菊内酯调控JAK/STAT信号通路对LPS诱导的肺泡上皮细胞损伤的影响

李海峰 林一春 陈岸东 林姝君 冯永锋

(1海南省临高县中医院内科，海南 临高 571800；2海口市中医院急诊科)

银胶菊内酯(PTN)是从菊科植物中分离出来的一种倍半萜类化合物，是一种很有发展前途的天然化合物,随着研究的深入，目前已发现了该化合物有较好的抗炎作用,还可诱导肿瘤细胞凋亡，将在治疗各种炎症、肿瘤等疾病方面发挥作用。肺泡上皮细胞具有屏障保护功能，肺组织损伤发生时,参与肺组织修复过程，该细胞凋亡是引发肺炎的重要原因之一〔1〕。既往研究表明，PTN常被作为一种治疗炎症性疾病的药物〔2〕。本研究采用LPS诱导肺泡上皮细胞建立炎症模型，探讨PTN通过调控Janus激酶(JAK)/信号转导转录激活因子(STAT)信号通路对LPS诱导肺泡上皮细胞损伤的影响。

1 材料与方法

1.1材料 BEAS-2B细胞(购于上海酶研生物科技有限公司，货号：Y-00805)；试剂：脂多糖(LPS 上海恒斐生物科技有限公司，货号：L8880)；DMEM培养基(北京伊塔生物科技有限公司，货号：YT8229)；胎牛血清(FBS 上海爱必信生物科技有限公司，货号：abs9*)；CCK-8试剂盒(上海弗元生物科技有限公司，货号：FY600001)；磷酸盐缓冲溶液(PBS 北京伊塔生物科技有限公司，货号：SY0950)；白细胞介素(IL)-6酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(北京索莱宝科技有限公司，货号：SEKH-0013)；IL-10 ELISA试剂盒(北京索莱宝科技有限公司，货号：SEKR-0006)Annexin V-FITC/PI 双染细胞凋亡检测试剂盒(上海弗元生物科技有限公司，货号FY600003-20T)；Bcl-2多克隆抗、酶切Caspase-3多克隆抗体、Bax多克隆抗体(武汉亚科因生物技术有限公司，货号：ABP57867/ABP0021/ABM0074)；p-JAK1多克隆抗体、p-JAK2多克隆抗体、p-STAT1多克隆抗体、p-STAT3多克隆抗体(武汉亚科因生物技术有限公司，货号：ABP57569/ABP0190)；电化学发光(ECL)显色剂(北京伊塔生物科技有限公司，货号：SY4918)。

1.2实验分组 采用含10% FBS的DMEM培养基常规培养BEAS-2B细胞，进行传代培养。取对数期细胞接种到6孔板，进行实验分组。对照组：除正常培养外，不做其他处理的BEAS-2B细胞；LPS组：采用终浓度为1 μg/ml的LPS处理正常培养的BEAS-2B细胞24 h；PTN低剂量组、PTN中剂量组、PTN高剂量组：分别采用终浓度为1、5、10 μmol/L PTN处理2 h后，给予1 μg/ml LPS刺激24 h。

1.3CCK-8法检测细胞存活率 使用 CCK-8法分析各组BEAS-2B细胞存活率。将各组BEAS-2B细胞接种在96孔板中，每组 6个平行，每个孔加入 100 μl PBS洗涤细胞并重复3次，加入 10 μl CCK-8检测溶液到每个孔中，继续孵育2 h。酶标仪设置 490 nm，测量每个孔的吸光度来计算细胞存活率〔3〕。

1.4流式细胞仪检测细胞凋亡 各组细胞培养在6孔板内，至长满孔底部面积80%后，吸出多余培养液，PBS洗涤细胞3次。加入1 ml胰酶消化液消化，几分钟后吸出消化液，加入细胞培养液轻轻吹打细胞，将混合液转移到离心管内，离心后弃去上清，收集细胞。加入PBS重悬细胞，取一定数量细胞转移至离心管，离心后弃去上清，按照试剂盒说明书分别加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI，室温条件避光孵育15 min，随后使用流式细胞仪检测细胞凋亡情况〔4〕。

1.5Western印迹检测细胞凋亡相关蛋白表达 从培养皿中吸去培养基，使用PBS冲洗细胞，加入RIPA细胞裂解液0.2 ml，置冰上裂解30 min，收集上清液，即为细胞总蛋白。将收集的蛋白样品100℃沸水加热 10 min，使蛋白充分变性，等样品冷却至常温，在10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)中分离。电泳结束后进行转膜，转膜装置从下至上排列，依次按阴极板、3层滤纸、凝胶、聚偏氟乙烯(PVDF)膜、3 层滤纸、阳极板的顺序放好。滤纸、凝胶、PVDF膜精确对齐，且每一层的气泡都要排尽。接通电源，转膜2 h。将转膜完毕的PVDF膜取出，浸泡于5%脱脂奶粉配制的封闭液中，37℃封闭1 h后洗膜，加入适宜浓度的Bcl-2、酶切Caspase-3、Bax、p-JAK1、p-JAK2、p-STAT1、p-STAT3多克隆抗体，清洗后加入二抗，封闭液中浸泡 2 h。参考相关说明书，使用 ECL 超敏发光试剂盒检测蛋白水平〔5〕。

1.6ELISA试剂盒检测炎症因子含量 取细胞培养上清液500 μl，离心5～10 min，取上清。利用 ELISA试剂盒检测细胞中IL-6、IL-10水平，使用前将所有试剂充分混匀，在测试孔中，加入待测标本和不同浓度的标准品，每个样品做两组平行实验。随后立即加入50 μl生物素标记的抗体，盖上膜板，轻轻振荡混匀，37℃孵育1 h，之后甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30 s，甩去洗涤液，用吸水纸拍干，重复此操作4次。每孔加入底物50 μl，轻轻震荡，37℃孵育15 min后，加入终止液，轻摇酶标板使之混匀，用酶标仪在450 nm波长下测得吸光度〔6〕。

1.7统计学分析 采用SPSS26.0软件进行单因素方差分析、LSD-t检验。

2 结果

2.1各组细胞存活率比较 LPS组〔(35.38±4.60)%〕细胞存活率显著低于对照组〔(100.00±0.76)%〕，说明构建细胞炎症模型成功；PTN低、中、高剂量组〔(41.68±1.14)%、(59.56±4.13)%、(75.03±6.66)%〕显著低于LPS组(P<0.05)。

2.2各组细胞凋亡率比较 流式细胞术结果发现，对照组、LPS组、PTN低、中、高剂量组细胞凋亡率分别为(4.11±0.59)%、(21.20±1.36)%、(16.07±1.26)%、(11.38±1.22)%、(7.31±1.03)%。LPS组与对照组差异显著(P<0.05)；PTN低、中、高剂量组分别与LPS组差异显著(P<0.05)。见图1。

图1 各组细胞凋亡率的比较

2.3各组凋亡相关蛋白表达比较 LPS组Bcl-2蛋白水平显著低于对照组，酶切Caspase-3和Bax蛋白表达量显著高于对照组(P<0.05)。PTN 低、中、高剂量组Bcl-2蛋白水平显著高于LPS组，酶切Caspase-3和Bax蛋白表达量显著低于LPS组(P<0.05)，见图2，表1。

2.4各组IL-6、IL-10水平比较 LPS组与对照组相比，IL-6含量升高，IL-10含量降低，差异有统计学意义(P<0.05)； PTN低、中、高剂量组与LPS组相比，IL-6含量降低，IL-10含量升高，差异显著(P<0.05)，见表2。

1～5：对照组，LPS组,PTN低剂量组,PTN中剂量组,PTN高剂量组；下图同图2 各组细胞凋亡相关蛋白表达的比较

表1 各组细胞凋亡相关蛋白表达的比较

表2 各组细胞中炎症因子含量比较

2.5各组JAK/STAT信号通路相关蛋白表达比较 LPS组与对照组相比，JAK/STAT信号通路相关蛋白表达均显著升高(P<0.05)；LPS组较PTN低、中、高剂量组显著降低(P<0.05)，见图3，表3。

图3 各组细胞中JAK/STAT信号通路相关蛋白表达比较

表3 各组细胞中JAK/STAT信号通路相关蛋白表达比较

3 讨 论

JAK/STAT信号通路是一类重要的细胞内信号转导通路家族〔7〕，此信号通路的激活与抑制炎症反应、氧化应激、细胞损伤、凋亡等有密切相关性〔8〕。有研究表明〔9〕，抑制JAK2/STAT3通路激活，可延迟肝脏、肺内高迁移率族蛋白-1的释放高峰，缓解肺泡上皮细胞损伤引起的致死性损伤，为早期诊疗提供广阔的时间窗，与本研究结果相符 。

IL-6是炎症形成的介质，是重要的非特异性炎性因子，参与全身炎症反应。IL-10是一种有效的抗炎性因子，通过阻断促炎性细胞因子、炎性趋化因子等发挥抗炎作用〔10〕。IL-10在防止宿主的损伤和维持组织内环境稳定方面起重要作用〔11〕。刘早阳等〔12〕研究结果说明IL-6作为一种促炎因子，其水平升高可促进肺损伤，而高水平IL-10 可减轻肺损伤。本研究结果提示炎症反应得到缓解，说明PTN可抑制LPS诱导的炎症反应。细胞凋亡由多种凋亡基因调控，其中促细胞凋亡蛋白Bax、Caspase-3和抗细胞凋亡基因 Bcl-2 是调控细胞凋亡的重要因子，在细胞凋亡的执行过程中具有关键作用〔13〕，Bax 和Bcl-2的比例决定了细胞是否凋亡〔14〕。免疫印迹结果说明PTN可抑制LPS诱导后的BEAS-2B细胞凋亡。

综上，PTN可通过调控JAK/STAT信号通路，提高LPS诱导后肺泡上皮细胞的存活率，抑制细胞凋亡，减轻炎症反应。