2型糖尿病患者内皮细胞基因差异表达与信号通路

徐魁 李敏才

(湖北科技学院 1临床医学院，湖北 咸宁 437100；2基础医学院)

糖尿病(DM)，特别是2型糖尿病(T2DM)是严重的代谢性疾病，高血糖将引起血管受损、动脉硬化和周围血管病变。DM患者由于高血糖引起的内皮细胞功能障碍是常见的病理现象，内皮细胞功能障碍导致视网膜微血管功能受损和肾小球滤过屏障的通透性下降，构成DM视网膜病变和DM肾病等并发症病变基础。本研究从DM患者和正常对照个体中分离真皮组织中内皮细胞，对其RNA测序(RNA-seq)进行比较差异表达的基因。

生物学研究的新领域——大数据基因表达芯片技术的出现，通过比较基因表达谱变化，筛选出与疾病相关的基因〔1〕。还可以对差异性基因参与的生物学过程、通路分析研究〔2〕。为研究T2DM患者与健康者内皮细胞的基因表达谱的差异性，以GSE92724芯片数据为样本〔3〕，运用基因富集分析(GSEA)软件，采用生物信息学方法对基因本体(GO)、京都基因和基因组百科全书(KEGG)通路和蛋白质相互网络(STRING)分析可能存在的分子机制、探索相关生物学通路和风险预测，为T2DM内皮细胞功能障碍治疗靶点奠定理论基础。

1 材料和方法

1.1样本数据来源 在Pubmed的GEO数据库中输入“type 2 diabetic patients”，选择GSE92724的芯片数据作为研究对象。该芯片数据样本来自4例T2DM患者、6例健康对照者外科手术切除的真皮组织，采用流式细胞仪(FACS)检测内皮细胞表面标志物(CD31+，CD45-，Podoplanin-)分离得到内皮细胞样本。

1.2数据分析 下载GSE92724的CEL文件，对探针水平的信号值进行数据归一化和基因注释处理，最终转化为基因表达水平的中位值〔2，4〕。

1.3差异性基因分析 对4例T2DM患者、6例对照者基因表达值，通过在线工具BioJupies软件分析差异性基因，继而对差异性基因进行火山图表示。通过倍比法(FC)和假发现率(FDR)筛选显著差异性基因分析，筛选条件：FDR<0.05，P≤0.01且|logFC|>1.5。对显著性差异化基因进行聚类热图分析〔5〕。

1.4GSEA 对处理后的GSE92724数据表达值，采用GSEA软件进行GO功能富集的生物学过程和KEGG的通路富集分析〔6〕，分析次数设置为1 000，并按分析的富集分数(ES)进行标准化(NES)值排序。

1.5蛋白质网路分析及核心基因分析 对GSEA分析得到的显著性差异基因(阈值为>0.4)进行STRING分析(https：/string-db-org.com)，将分析得到的数据导入Cytoscape得到蛋白质表达网络图，并进行核心基因表达分析〔7〕。

1.6统计学方法 本实验结果均采用相关软件检验标准，检验水准：α=0.05，P<0.05有统计学意义。在线R软件BioJupies分析差异表达基因，采用倍数变化和显著性分析，设置P≤0.05 且|logFC|>1.5。GSEA软件GO功能富集分析和KEGG通路富集分析采用软件推荐P<0.01。PPI软件和Cytoscape软件分析采用推荐P<0.05。

2 结 果

2.1基因芯片数据差异性分析 通过对探针水平的信号值进行质控、变异稳定性分析、背景校正、数据归一化处理，对基因表达谱中位值进行差异基因分析，发现T2DM患者与健康对照者内皮细胞的差异表达基因1 633个(P<0.05)，进一步筛选出极其显著性差异表达基因，筛选条件：P<0.05并且|log2FC|>1.5，共筛选出777个，其中表达上调基因126个，表达下调基因651个。按Pearson系数进行聚类绘制成热图，前75个基因的表达结果见图1。

图1 前75个显著性差异表达基因的聚类热图

2.2GO功能富集分析 GO富集分析包括生物学过程(BP)，分子功能(MF)和细胞成分(CC)，选取BP分析，功能分析显示T2DM中上调基因参与多个生物学过程，排在前5位生物学过程分别为呼吸爆发的正性调节(GO：0060267)、免疫效应过程调节(GO：0002697)、体液免疫反应调节(GO：0002920)、蛋白质激活级联调节(GO:0000257)、蛋白质加工调节(GO:0070613)；T2DM下调基因参多个生物学过程，排在前5位生物学过程：表皮发育(GO:008544)、乳腺上皮发育(GO:0061180)、乳腺发育(GO:0030879)、建立皮肤屏障(GO:0061436)、皮肤发育(GO:0043588)。

2.3KEGG通路富集分析 KEGG通路分析显示T2DM上调基因参与多个通路调节，排在前5位通路调节：类风湿关节炎(hsa05323)、疟疾(hsa05144)、自身免疫性甲状腺疾病(hsa05320)、造血细胞谱系(hsa04640)、金黄色葡萄球菌感染(hsa05150)；T2DM下调基因参与多个通路调节，排在前5位通路调节：黑色素(hsa04916)、癌症中的蛋白多糖(hsa05205)、基底细胞癌(hsa05217)、干细胞多能性信号通路(hsa04550)、细胞因子-受体相互作用(hsa04060)。

2.4蛋白质相互作用和核心基因分析 彩色标记的核心基因位于枢纽位置见图2。

图2 显著性差异基因的蛋白质网络

以P值≤0.01 且|logFC|>2为条件得到659个极其显著性差异表达基因输入在线STRING软件，分析结果显示节点值622，边缘值2 084，预期边缘值914，PPI富集呈显著差异，主要体现在组织发育、上皮发育、系统发育等生物学过程，分子功能表现为Ca离子结合、DNA结合转录激活因子活性、Frizzled连接、信号受体结合等。将分析得到的蛋白质之间的相互作用得分值输入Cytoscape，得到蛋白质相互作用网络图。在评分>300条件下进行核心基因筛选，得到CCL20、LPAR3、LPAR1、LPAR5、NMU、PTGER3、S1PR5、CCL27、ACKR3等核心基因。

3 讨 论

内皮细胞作为血管壁的屏障，调节血流量和血管张力，维持血管稳态。内皮细胞功能障碍〔8〕是指血管舒张因子(一氧化氮、前列环素、内皮衍生超极化因子等)和血管收缩因子(内皮素、血管紧张素Ⅱ、血栓烷等)的平衡失调，导致血管收缩功能增强。内皮功能障碍是多种血管疾病的早期阶段，如心血管内皮细胞功能障碍是动脉粥样硬化的始动因素，氧化的低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)接触损伤的内皮并积聚在内皮下，逐渐形成动脉粥样硬化斑块〔9〕。内皮功能障碍是DM最有害的事件之一〔10〕。DM循环中的高葡萄糖引发内皮功能障碍和细胞凋亡，会加速动脉粥样硬化血管疾病，形成的继发性病变如DM肾病、DM视网膜病变、DM足。因而DM内皮细胞功能失调，被认为是血管病变的首发因素。基因芯片的大数据测试能发现基因表达谱改变，为揭示疾病的分子机制提供帮助。在DM真皮血管内皮细胞与健康对照组的差异性基因中，进行GO富集分析得到上调的生物学过程：呼吸爆发的正性调节〔11〕，免疫效应过程调节〔12〕、体液免疫反应调节〔13，14〕等。氧化应激是导致其内皮功能障碍的最重要机制之一，通常丙二醛(MDA)反映机体氧化应激水平，而超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)及谷胱甘肽(GSH)可反映机体的抗氧化应激水平。因而DM患者生物学过程表现出呼吸爆发的正性调节〔11〕。在DM真皮血管内皮细胞的富集差异基因GO分析中，与对照组相比，一些下调的生物学过程：如GO功能富集的表皮发育、乳腺上皮发育、乳腺发育，符合DM患者表皮生长发育迟缓、皮肤中腺上皮发现缓慢，与相关的文献报道研究相一致〔15〕。研究发现类风湿关节炎与DM存在明显的相关性〔16〕，DM作为疟疾的危险因素存在〔17〕。同样在大数据分析中，自身免疫性甲状腺疾病、类风湿关节炎与DM之间存在明显的富集相关性〔18〕。

KEGG通路富集研究中，发现黑色素、癌症中的蛋白多糖、基底细胞癌等通路下调。DM皮肤病变中，存在与正常组织不一样的调节方式〔19〕。血浆中的蛋白多糖完全可成为DM的评价指标〔20〕。大数据分析显示14个新等位基因与基底细胞癌发生有关，提示DM发生基底细胞癌的概率减少，以往报道DM患者皮肤肿瘤性疾病较少相一致〔20〕。

将GSE92724芯片数据中差异表达基因谱导入，通过STRING分析结果值导入Cytoscape分析：主要有核心基因趋化因子(CCL)20、CCL27〔21〕、溶血磷脂受体(LPAR)1、LPAR3〔22〕、神经介质(NM)U〔23〕、前列腺素E2受体EP3亚型(PIGER3)、鞘氨醇1-磷酸受体(S1PR)5〔24〕、非典型趋化因子受体(ACKR)3〔25〕。以往研究发现，DM患者中趋化因子〔21〕及受体〔25〕表达上调，介导DM中炎症病变，核心基因PIGER3也证实这一过程〔26，27〕。在部分DM患者中，表现溶血磷脂受体〔22〕和鞘氨醇-磷酸受体上调〔24〕，与脂质代谢、炎症病变相关。