奶山羊羔羊山羊痘的病理学、血清学及分子生物学诊断

王 娜，张 帆，宋 越，白 帆，戴伶俐，张月梅，李晓燕，周 渊，王建光，王根云，赵世华

（1. 内蒙古自治区农牧业科学院， 内蒙古 呼和浩特 010031；2. 呼和浩特市动物疫病防控中心， 内蒙古 呼和浩特010020；3.内蒙古盛健生物科技有限责任公司，内蒙古 呼和浩特 011500）

山羊痘（goatpox）又称羊天花，是由山羊痘病毒（goatpox virus，GTPV）感染引起的一种急性、热性、接触性传染病［1-2］。 山羊痘病毒具有宿主特异性，常感染不同年龄、不同性别、不同品种的山羊，且羔羊多发，仅少数毒株可感染绵羊，偶见感染人［3-4］。 该病的流行无明显季节性，山羊一般在冬末春初易感［5-7］。 感染该病的山羊体温升高，呼吸急促，流黏性或脓性鼻液［5-6］，口、鼻、被毛下皮肤等部位出现丘疹、结节或水疱，逐渐扩散到内脏，感染后期症状严重可致死， 整个病程持续21～28 d［8］。患病羊自愈将获得终身免疫［9］。

山羊痘在世界各地流行，主要集中于印度、孟加拉国、北美、中非等国家和地区［10］。近年来，随着山羊养殖密度的增加， 该病已流行于我国部分地区，如内蒙古、江苏、贵州、重庆［11-14］。 不同山羊痘病毒毒株的毒力存在差异， 易感羊只的病死率较高，部分羊场羔羊的死亡率为100%［15］。 该病对我国养羊业健康可持续发展造成威胁， 严重影响羊及其制品的出口。 世界动物卫生组织将该病列为报告传染病，我国也将其列为Ⅰ类动物疫病［16-17］。

山羊痘病毒是双股DNA 病毒，分子量约150kb，包含147 个开放阅读框（ORF）。ORF074 编码囊膜蛋白P32，该蛋白由319～324 个氨基酸组成，包含1 个重要的抗原决定簇，能刺激机体产生抗体［18］，是亚单位疫苗的首选可溶性蛋白。 P32 基因可作为山羊痘病毒分子生物学鉴定的靶基因。 该研究通过病理解剖学观察、病理组织学检查、血清学检测以及病原PCR 鉴定方法，对内蒙古某规模化奶山羊养殖场部分引进羔羊发生的疑似山羊痘进行综合诊断， 以期为该地区养殖场控制山羊痘的发生及流行提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 待检病料

2021 年9 月内蒙古某规模化养殖场部分引进奶山羊羔羊出现精神萎靡、体温升高、呼吸困难的临床症状，全身皮肤出现红色疹痘或水疱，鼻腔及眼周围存在大量脓性分泌物， 疑似山羊痘病毒感染。发病羔羊无山羊痘病毒疫苗接种史。解剖1只临床症状严重的羔羊，无菌采集血液、肺组织（编号：GTPV-YP1）、鼻拭子（编号：GTPV-YP2）、眼拭子（编号：GTPV-YP3）样本各1 份，置于-20 ℃车载冰箱，带回实验室检测。

1.1.2 主要试剂

病毒DNA 提取试剂盒，购自宝生物工程（大连）有限责任公司；山羊痘病毒抗体高敏荧光检测试剂盒， 购自成都微瑞生物科技有限责任公司；采血贮血器，购自三门县民生医药器材有限公司；山羊痘病毒活疫苗， 购自重庆奥龙生物制品有限公司。

1.1.3 仪器设备

高速离心机（型号：pico 17），赛默飞世尔科技（中国） 有限责任公司产品； 恒温水浴锅（型号：SH-WB-6GDN3）， 韩国三兴有限责任公司产品；恒温摇床（型号：TS-2112B），上海比朗仪器制造有限责任公司产品；旋涡振荡器（型号：VM-10），大韩科学有限公司产品；PCR 仪（型号：ABI9902）、电泳仪（型号：HE99X）、全自动凝胶成像仪（型号：Type T2A），美国伯乐有限责任公司产品。

1.2 试验方法

1.2.1 病理解剖与病理组织切片观察

解剖发病山羊， 无菌采集病死羊的肺脏病变样本，立即用10%福尔马林固定。病理切片于内蒙古医科大学实验动物中心制作。

1.2.2 血清抗体检测

1.2.2.1 血液采集与血清制备

使用一次性无菌采血器采集病羊颈静脉血液，标记羊耳标号， 常温放置1 h 或37 ℃静置30 min，然后冷藏保存。 将采集的血液样本3 000 r/min 离心10 min，取上层清亮液体进行检测。

1.2.2.2 高敏荧光法检测山羊痘病毒抗体

试样加入检测卡后， 试样中的山羊痘病毒抗体与标记荧光微球的抗原发生免疫反应， 形成免疫复合物。该复合物随样液流至检测线，被包被的特异性抗原捕获并形成双抗原夹心免疫结合物。该结合物的量与试样中山羊痘病毒抗体的量正相关， 经高敏荧光免疫分析仪测定结合物中示踪物的荧光强度， 即可确定试样中山羊痘病毒抗体的含量或免疫效价。

试剂盒和血清样本恢复至室温， 取待检血清10 μL，加入490 μL 的稀释液，旋涡振荡器混匀，取80 μL 混匀液加入检测卡， 避光静置15 min 上机检测。 抗体效价≤16，判定抗体保护水平阴性；抗体效价＞16， 判定抗体保护水平阳性；10≤抗体效价＜16，判定抗体保护水平可疑。 检测抗体效价与山羊痘病毒抗体含量成正比。

1.2.3 山羊痘病毒分子生物学检测

1.2.3.1 待检样本病毒基因组DNA 提取

在1 份病肺组织中加入约3 倍体积的生理盐水进行充分匀浆，4 ℃12 000 r/min 离心10 min，留上清液； 在2 份拭子样品中加入600 μL 生理盐水，反复吹打，4 ℃12 000 r/min 离心10 min，留上清液；取山羊痘病毒活疫苗悬液、1 份肺组织研磨液、2 份拭子样品处理液各200 μL， 病毒基因组DNA 提取操作步骤按照TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0 试剂盒说明书，提取后的病毒基因组DNA 置于-20 ℃保存。

1.2.3.2 P32 基因PCR 扩增及序列分析

根据参考文献［19］ 设计P32 基因PCR 扩增引物，上游引物（GTPV-P32-F ）序列： 5′-CACCGAATTCACCATGGCAGATATCCCATTATAT-3′，下游引物（GTPV-P32-R）序列：5′-GATGGCGGCCG CAACTATATACGTAAATAAC-3′，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。 预期扩增产物片段大小为983 bp。 以“1.2.3.1”项下提取的山羊痘病毒基因组DNA 作为模板进行PCR 扩增。 PCR 反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，30 次循环；72 ℃保持7 min。PCR 反应体系（25 μL）：PCR mix 12.5 μL，上游引物（GTPV-P32-F）0.5 μL，下游引物（GTPV-P32-R）0.5 μL，模板1.0 μL，ddH2O 10.5 μL。 阴性对照以ddH2O 为模板， 阳性对照以提取的山羊痘病毒活疫苗DNA 为模板。 PCR 扩增产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳初步鉴定后， 低温寄送生工生物工程（上海） 股份有限公司测序。 利用NCBI 数据库中的BLAST 模块进行P32 基因序列比对，利用MegAlign 8.0 软件构建系统发育树。

2 结果与分析

2.1 病理学诊断

2.1.1 病理解剖学观察

剖检可见病羊口腔、鼻腔、喉头、气管黏膜有大小不一的圆形疹痘；肺部明显水肿，伴有卡他性肺炎；肺脏表面存在红色疹痘，切开后呈不透明、灰白色胶冻样；瘤胃、网胃、瓣胃、皱胃黏膜均出现疹痘（见图1）。

图1 发病羔羊临床症状及病理解剖学特征

2.1.2 病理组织学检查

采集发病羊只肺脏组织， 制作石蜡切片。 经HE 染色可见肺泡间质变宽，腔内存在脱落的上皮细胞； Ⅱ型肺泡上皮细胞增生， 并化生为腺泡样状；支气管腔内存在大量的炎性细胞（见图2）。

图2 发病羊只肺部病理组织切片（HE，100×）

2.2 血清学诊断

采集的1 份病羊血清经山羊痘病毒抗体高敏荧光检测试剂盒检测，抗体效价为108，大于16，提示山羊痘病毒抗体检测呈强阳性。

2.3 分子生物学诊断

选取3 份临床样品及1 份山羊痘病毒疫苗提取基因组DNA，进行P32 基因PCR 扩增，均获得983 bp 的扩增产物，与预期大小一致（见图3）。 阳性扩增产物测序后，通过BLAST 比对，构建系统发育树（见图4），并进行同源性分析（见图5）。 结果显示， 肺组织（GTPV-YP1）、 鼻拭子（GTPVYP2）样本P32 基因序列遗传关系密切，处于同一分支， 与山羊痘病毒中国分离株KC951854.1、Oman 分离株MN072621.1 亲缘关系最近，同源性达到100%；GTPV-YP1 和GTPV-YP2 与GTPV-YP3处于不同分支，同源性均为98.7%，且GTPV-YP3与山羊痘病毒中国分离株 EF514892.1、HM572329.1、JN596275.1、MG817382.1 亲 缘 关 系最近，同源性达到99.0%。

图3 发病羊只临床样本P32 基因PCR 扩增产物凝胶电泳检测结果

图4 基于山羊痘病毒P32 基因构建的系统发育树

图5 基于山羊痘病毒P32 基因的同源性分析

3 讨论

山羊痘发病快、传染性强、死亡率高，易造成妊娠母羊流产［20］。该病已流行于世界各地，且在我国多个省份流行，给养羊业带来巨大的经济损失。虽然养殖场和牧户定期对羊只进行山羊痘病毒疫苗接种，但该病在局部地区仍有散发，可能由于疫苗皮内注射操作时出现漏针，未达到免疫效果。

该研究通过临床症状初步确定该场部分羊只疑似感染山羊痘病毒，剖检可见口腔、鼻腔、喉头、气管以及瘤胃、网胃、瓣胃、皱胃黏膜出现红色疹痘，为典型的山羊痘症状。无菌采集发病羊只的肺组织、鼻拭子、眼拭子各1 份，通过P32 基因进行山羊痘病毒的分子生物学鉴定。 生物信息学分析结果显示，3 份临床样本中的山羊痘病毒P32 基因与野毒感染株属于同一分支，亲缘关系较近，与疫苗株亲缘关系较远；3 份临床样本与牛结节性皮肤病病毒的P32 基因处于不同分支， 但同源性较高，均大于97.7%。 综合分析，接种山羊痘病毒疫苗可能会有效预防结节性皮肤病， 有望用于结节性皮肤病的防控。

据了解，该场发病羔羊从主产区引进，经长途调运至该场饲养，因群体由不同养殖户收购后合群，部分羊只的山羊痘病毒疫苗基础免疫情况并不确定，再加上综合应激因素导致群发。 因此，调运前加强免疫和抗体监测预警可有效预防该病发生。

4 结论

经病理解剖学观察、病理组织学检查、血清学检测以及病原PCR 鉴定，确定引起该场引进奶山羊羔羊发病的原因为山羊痘病毒感染。