猫疱疹病毒Ⅰ型HB株的分离鉴定及其免疫原性初步评价

张国军,任洪林,杨 举,张嘉桐,杨延梅,畅丽芳,陈建国,陈 博,齐 宇* (.吉林大学 人兽共患病研究所 人兽共患病研究教育部重点实验室，吉林 长春 006；.吉力生物科技有限公司，浙江 宁波 56；.吉林大学 致远有限公司，吉林 长春 00；.吉林大学 科研院西区科技办公室,吉林 长春 006)

猫病毒性鼻气管炎病是一种猫的上呼吸道高度接触性急性传染病，幼猫发病率可达100%，死亡率50%，成年猫死亡率很低，是猫的重要呼吸道疾病之一。本病病原是猫Ⅰ型疱疹病毒(FHV-1)，自然条件下经呼吸道和消化道感染，也可通过飞沫迅速传播。该病毒目前只有一种血清型被确认，但其毒力在各病毒株之间各有不同，通常情况下只感染猫。我国宠物猫在4 000万只以上，猫感染后，病毒能在病猫鼻腔、咽喉、气管、结膜和舌上皮细胞内繁殖，并随其分泌物排到体外。有些猫感染后不呈现症状，称为隐性感染，但仍能向外排出病毒[1]。因此，当健康猫接触了被病毒污染的饲料、水、用具和周围环境时，就可引起本病传播。由于本病症状与猫杯状病毒(FCV)感染和猫肺炎(衣原体感染)有相似之处，故临床诊断较难[2]。目前国际市场已有预防猫鼻气管炎的灭活疫苗和弱毒苗，主要为联苗形式。我国目前预防猫病毒性鼻气管炎较多的产品是妙三多三联灭活疫苗，为进口产品，价格高，目前还没有自主知识产权的疫苗产品。因此，为加强国产疫苗研发和知识产权独立性，有必要研制国产疫苗，以解决目前国内面临的疫苗短缺问题。

本试验从临床患病猫气管分离到1株猫疱疹病毒(FHV)，将其命名为FHV-HB株，并对其特性进行了初步分析，结果显示该毒株免疫原性好且免疫防护力高，成为猫鼻气管炎疫苗候选株的潜力大，目前相关研究正在继续，现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 病料采集2014年河北保定某猫舍幼猫发病，临床表现为打喷嚏，眼、鼻部出现大量分泌物，几日后眼部、鼻部被分泌物封死，食欲废绝，呼吸困难并死亡，疑似猫病毒性鼻气管炎病毒感染。

1.2 细胞株及试剂猫肾细胞(F81细胞)购自武汉普诺赛生命科技有限公司；FHV阳性血清(SN≥1∶32)由吉林大学人兽共患病研究所惠赠；Ex Taq DNA聚合酶、pMD18-T载体、E.coliDH5α感受态细胞购自宝生物工程(大连)有限公司；DNA提取试剂盒与胶回收试剂盒购自AXYGEN公司；DMEM培养基购自南京生航生物技术有限公司；PCR引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。

1.3 试验猫2～3月龄中华田园猫，购自长春市某宠物市场，测定疱疹病毒抗体阴性或中和抗体≤1∶2。

1.4 试验仪器德国HERAcell BB15二氧化碳培养箱；奥林巴斯CKX53倒置生物显微镜；ABI梯度PCR仪。

1.5 病毒分离

1.5.1病料处理 采集发病猫鼻拭子于盛有0.5 mL DMEM培养基(含100 U/mL青霉素和100 g/L 链霉素)的离心管中，用于病毒分离。

1.5.2病毒培养 取1.5.1装有鼻拭子的离心管，12 000 r/min离心20 min，吸取上清液，在无菌条件下用0.22 μm细菌滤器过滤除菌，接种过滤液1 mL于F81单层细胞，37℃感作2 h，弃掉过滤液，补加维持液，将细胞培养板置于37℃、5% CO2培养箱中培养。每日观察细胞，将出现病变(CPE)的细胞冻融1次，收集细胞培养液进行鉴定。

1.6 分离病毒鉴定

1.6.1中和试验 将出现CPE细胞的培养液用DMEM细胞培养液稀释为200 TCID50/0.1 mL，与FHV特异性阳性血清(SN≥1∶32)等量混合，置37℃下中和1 h，接种已长成单层、弃去细胞培养液的96孔板中培养的F81细胞(2孔)，37℃孵育2 h后，弃去病毒-血清中和液，加入0.1 mL含2%胎牛血清的DMEM细胞培养液；同时设正常细胞对照、病毒对照各2孔。将96孔板置于37℃、5% CO2培养箱中培养观察48 h。

1.6.2核酸鉴定 提取病毒液的DNA与RNA。采用FPV、FCV和FHV的特异性引物，通过PCR或RT-PCR方法进行鉴定，引物相关信息见表1。

表1 FHV、FCV、FPV检测用引物序列及相关信息

1.6.3病毒的形态学观察 将病毒液4℃，10 000 r/min离心30 min，取上清液加入0.5%磷钨酸溶液染色，用透射电子显微镜观察其形态学特征。

1.6.4毒力测定 将第5代细胞培养物用生理盐水10倍系列稀释至105，106，107TCID50/mL，病毒感染途径为滴鼻和口服，将病毒接种于2月龄以上，FHV中和抗体不高于1∶2的临床健康猫，每组5只，每只2.0 mL，观察14 d。

1.6.5免疫原性测定 将第5代病毒培养液稀释至105.5TCID50/mL，用0.2%的甲醛溶液灭活后加入疫苗稀释液，皮下接种2～3月龄临床健康中华田园猫(FHV中和抗体≤1∶2)4只，每只1 mL，接种后21 d以相同剂量和相同免疫途径加强免疫1次。另取条件相同的3只猫不接种作为空白对照。加强免疫后21 d分别采集免疫猫和对照猫血液，分离血清，测定猫鼻气管炎病毒中和抗体效价。加强免疫后21 d，通过滴鼻途径进行攻毒试验，每只猫接种病毒滴度为107.5TCID50/mL的FHV HB株培养液2.0 mL，正常饲养，观察14 d。

2 结果

2.1 病毒分离结果正常F81细胞生长良好，边缘清晰，形态均匀一致(图1A)。接种病毒后24 h，F81细胞开始出现明显的CPE：细胞圆缩，聚集成团，细胞间隙变大，聚集成“葡萄串样”群落(图1B)。

A.正常细胞；B.接毒后48 h细胞图1 正常F81细胞及感染FHV F81细胞的显微镜观察结果

2.2 病毒的鉴定结果

2.2.1中和试验鉴定结果 用通过FHV阳性血清中和分离的第3代病毒，混合感作后接种细胞，接种后4 d观察细胞，阳性血清中和组接毒后未出现CPE，阴性血清中和组和病毒对照组细胞均出现了CPE，表明所分离的病毒为FHV，并且有致病性。

2.2.2核酸鉴定结果 通过FHVgD基因特异性引物对病毒细胞培养上清进行PCR扩增，得到与预期片段大小相符的目的条带(图2)。

M.DL2000 DNA Marker；1.病毒细胞培养物的FPV鉴定引物PCR扩增结果；2.FHV鉴定引物PCR扩增结果；3.FCV鉴定引物RT-PCR扩增结果；4.F81对照细胞上清的FHV鉴定引物PCR扩增结果图2 第5代细胞培养物PCR扩增结果

扩增获得的包含FHVgD基因的序列测定结果表明，FHV HB株与已发表的病毒株核酸序列同源性均较高。利用扩增序列和基因数据库中已有序列构建的遗传进化树如图3所示。

图3 FHV HB株gD基因的遗传进化树

2.2.3病毒形态观察结果 病毒经磷钨酸染色后，透射电镜观察可见到典型的疱疹病毒的病毒粒子(图4)，将病毒命名为FHV-HB株。

图4 FHV-HB株透射电镜照片(×40 000)

2.2.4病毒滴度(TCID50)测定结果 按照Reed-Muench法计算FHV HB株分离毒的第5代细胞培养物的滴度为107.5TCID50/mL。

2.2.5毒力测定结果 以107.5TCID50/mL剂量接种实验猫，接种后全部试验猫出现眼屎、脓涕、喷嚏、呼吸困难等发病症状(图5)，5只试验猫均在14 d内死亡。

图5 攻毒后试验猫临床症状观察

2.2.6免疫原性检测结果 将F81细胞培养传代的FHV HB株第5代毒的病毒培养液(107.5TCID50/mL)，经体积分数为0.2%的甲醛溶液灭活后，皮下接种临床健康易感中华田园猫，21 d后加强免疫1次。另取未接种的3只条件相同的中华田园猫作为空白对照。加强免疫后21 d，分别采集血液，分离血清，测定FHV中和抗体效价，免疫原性鉴定结果见表2。

表2 FHV HB株第5代毒免疫原性鉴定结果

通过表2可知，灭活FHV HB株(107.5TCID50/mL)可诱导机体产生较好的中和抗体，对FHV具有较强抵抗作用。免疫攻毒结果表明，用该剂量的灭活FHV HB株免疫2次后可提供完全的攻毒保护，说明灭活的FHV HB株具有很好的免疫原性。

3 讨论

近年来，随着人们生活水平的提高，猫作为伴侣动物已逐渐成为城市生活不可或缺的一部分，宠物健康也逐渐成为世界宠物行业关注的热点。我国养猫数量逐年增多，且有相当数量的野猫群体，传染性疾病常成为宠物猫患病和死亡的主要因素[3-4]。猫传染性鼻气管炎作为宠物猫常见的病毒性传染病之一，一般来说仅感染猫，引起病猫出现上呼吸道炎症和结膜炎[5-8]。本试验从河北某宠物医院送检的疑似患鼻气管炎病的猫气管中成功分离出1株FHV，其糖蛋白gD能够凝集红细胞和诱导体液免疫反应，对其gD基因进行了测序及分析，结果表明分离病毒gD基因序列[9]与GenBank中已发表的序列同源性为100%，通过病毒形态观察、血清中和试验及基因序列分析，表明该病毒分离株为FHV-1。

FHV-1属于一种典型的α-疱疹病毒，具有复制周期短、传播迅速以及引起潜伏感染等特点[10]。临床康复的猫会成为潜伏感染的病毒携带者，潜伏期间会传染无抗体的其他猫，且当自身受到应激时，病毒经历周期性的活化，引起二次感染[11]。由于该病毒引起的抗体持续时间短，抗病能力弱，细胞免疫在该病控制上也很重要。本病的预防主要依靠疫苗防控，常规的灭活和减毒活疫苗可以提供有效保护，但国内还缺乏针对性疫苗的开发，这也是本试验的主要目的之一。治疗性药物主要包括赖氨酸、干扰素以及阿昔洛韦、泛昔洛韦等核苷类抗疱疹病毒药物，但是这些药物的治疗效果总体上欠佳[12-13]。本试验分离到的FHV第5代毒的滴度为107.5TCID50/mL，灭活后免疫猫可抵抗强毒攻击，具有良好的免疫原性，而且以107.5TCID50/mL剂量感染组中的实验猫均出现本病相应的临床症状，说明该毒株可作为疫苗检验用毒株。本试验对分离毒株进行了鉴定和免疫保护试验，结果可为猫鼻气管炎病的疫苗研发奠定基础。