茺蔚子中苷类成分及其肝细胞保护作用研究

范云秋 彭芳 何育霖彭成戴鸥周勤梅熊亮*

（1.成都中医药大学药学院，省部共建西南特色中药资源国家重点实验室，四川 成都611137； 2.成都中医药大学西南特色药材创新药物成分研究所，四川 成都611137； 3.成都中医药大学中医药创新研究院，四川 成都611137）

茺蔚子味辛、苦，性微寒，是唇形科植物益母草Leonurus japonicusHoutt.的干燥成熟果实，具有活血调经、清肝明目的功效，临床中常用于月经不调、经闭、痛经等症［1］，药用历史悠久，早在《本草纲目》 中就有记载［2］。茺蔚子含有丰富的脂肪酸、氨基酸［3］，以及三萜、甾体、生物碱、芳香族等类型［4-6］，并且其正丁醇部位具有较好的肝细胞保护作用。本实验从茺蔚子中分离得到7 个化合物，包括4 个苯乙醇苷类、3 个酚苷类，其中化合物2、4～7 为首次从该植物中分离得到，4、5 均具有显著的肝细胞保护作用。

1 材料

1.1 仪器 Bruker-500、Bruker-600 核磁共振波谱仪（德国Bruker 公司）；Synapt G2 HDMS 型高分辨质谱仪（美国Waters 公司）；UPT-II-20T 型反渗透纯水仪（成都超纯科技有限公司）；RotavaporR-205 旋转蒸发仪（瑞士Buchi 公司）；Agilent 1220型半制备型高效液相色谱仪（美丽Agilent 公司）；DZKW-S-4 电热恒温水浴锅（北京市永光明医疗仪器有限公司）；FA2004B 电子天平（上海越平科学仪器有限公司）；SW-CJ-2F 型双人双面净化工作台（苏州净化设备有限公司）；Allegra X-12R 离心机（美 国Beckman Coulter公司）；Series ⅡWater Jacket CO2孵箱、Multiskan MK3 酶标仪（美国Thermo Scientific 公司）。离子交换树脂（河北华伟树脂厂）；D101 大孔吸附树脂（安徽三星树脂科技有限公司）；柱层析硅胶（200～300 目）（青岛海洋硅胶干燥剂厂）；薄层层析硅胶GF254、硅胶G和硅胶H（青岛海洋硅胶干燥剂厂）；高效薄层硅胶板，GF254 硅胶制备薄层（烟台江友硅胶开发有限公司）；HW-40F（日本TOSOH 公司）。

1.2 试剂与药物 HL-7702 正常人肝细胞（博士德生物科技有限公司，批号CX0157）。DMEM 培养基（美国Gibco 公司，批号8121052）；胰蛋白酶（北京索莱宝科技有限公司，批号910O041）；新生牛血清（浙江天杭生物科技股份有限公司，批号20100201）；对乙酰氨基酚（成都克洛玛生物科技有限公司，批号CHB210112）；噻唑蓝（北京金泰宏达生物科技有限公司，批号EZ6789A155）；二甲基亚砜（成都科龙化工试剂厂）。乙醇、乙酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷、甲醇为分析纯（成都科龙化工试剂厂）；甲醇为色谱纯（美国Sigma公司）。

1.3 药材 茺蔚子于2016 年9 月购自成都市荷花池药材市场，经成都中医药大学中药鉴定教研室李敏教授鉴定为益母草Leonurus japonicusHoutt.的成熟果实，标本（SCWZ-0917）保存于成都中医药大学西南特色药材创新药物成分研究所。

2 提取与分离

取茺蔚子60 kg，加入8 倍量70%乙醇回流提取3次，每次2 h，提取液合并后减压浓缩，得3.5 kg 醇浸膏，分散于水中，依次采用乙酸乙酯、正丁醇萃取，回收溶剂，分别得到乙酸乙酯部位（900 g）、正丁醇部位（1 800 g）。将正丁醇部位经大孔树脂柱分离纯化，依次用10%、30%、50%、70%、95%乙醇洗脱，回收溶剂后得到5 个洗脱部分F1～F5。

采用碱性硅胶柱对F2进行分离，以二氯甲烷-甲醇（50∶1～0∶1）为流动相梯度洗脱，洗脱液经TLC 检测，合并相似部分，回收溶剂，得到17个洗脱部分F2-1～F2-17。F2-14（6.5 g）经离子交换树脂柱，分别用纯水、80%乙醇、80%氨水乙醇梯度洗脱，取80% 氨水乙醇洗脱部位，回收溶剂，经HW-40F 凝胶柱（90%甲醇）分离，得到4 个洗脱部分F2-14-1～F2-14-4，F2-14-3经硅胶柱，以二氯甲烷-甲醇-水（50∶1∶0～3∶2∶0.25）为流动相梯度洗脱，得到6 个洗脱部分F2-14-3A～F2-14-3F，F2-14-3D经反相半制备液相色谱（28% 甲醇）得化合物2（2.2 mg，tR＝49 min）。F2-15（23.0 g）经反相中压液相色谱，以5%～100%甲醇为流动相梯度洗脱，得到17 个洗脱部分F2-15-1～F2-15-17，F2-15-2经硅胶柱、反相半制备HPLC（30% 甲醇）得化合物3（2.0 mg，tR＝34 min）、5（2.4 mg，tR＝45 min）；F2-15-12经硅胶柱、反相半制备HPLC 得2 个部分F2-15-12-1～F2-15-12-2，F2-15-12-1以37%甲醇为流动相洗脱得化合物6（2.0 mg，tR＝74 min），F2-15-12-2以45%甲醇为流动相洗脱得化合物1（2.0 mg，tR＝45 min）、7（2.0 mg，tR＝60 min）；F2-15-14经硅胶柱、反相半制备HPLC（45% 甲醇）得化合物4（2.0 mg，tR＝47 min）。

3 结构鉴定

化合物1：白色粉末，易溶于甲醇；TLC 检测有强暗斑，碘蒸熏显黄色，10%硫酸乙醇溶液显色呈紫色。ESI-MSm／z307.1 ［M ＋Na］＋；1H-NMR（600 MHz，CD3OD）δ：7.26（4H，m，H-2，3，5，6），7.18（1H，m，H-4），4.30（1H，d，J＝7.8 Hz，glc-1），4.09（1H，m，H-8a），3.86（1H，dd，J＝12.0，2.4 Hz，glc-6a），3.76（1H，m，H-8b），3.66（1H，dd，J＝12.0，5.4 Hz，glc-6b），3.34（1H，m，glc-3），3.23～3.29（2H，m，glc-2，4），3.19（1H，dd，J＝9.0，7.8 Hz，glc-5），2.94（1H，dd，J＝7.8，3.6 Hz，H-7a），2.93（1H，dd，J＝7.8，3.0 Hz，H-7b）；13C-NMR（150 MHz，CD3OD）δ：140.1（C-1），130.0（C-3，5），129.3（C-2，6），127.2（C-4），104.4（glc-1），78.1（glc-5），78.0（glc-3），75.1（glc-2），71.7（C-8），71.7（glc-4），62.8（glc-6），37.2（C-7）。与文献［7］报道的β-苯乙醇葡萄糖苷一致。

化合物2：白色粉末，易溶于甲醇；TLC 检测有强暗斑，碘蒸熏显黄色，10%硫酸乙醇溶液显色呈紫 色。ESI-MSm／z477.2 ［M ＋H］＋；1H-NMR（600 MHz，CD3OD）δ：6.82（1H，d，J＝8.4 Hz，H-5），6.73（1H，d，J＝1.8 Hz，H-2），6.68（1H，dd，J＝8.4，1.8 Hz，H-6），5.16（1H，brs，rha-1），4.30（1H，d，J＝7.8 Hz，glc-1），4.07～3.26（m，10H of glucose and rhamnose），3.82（3H，s，OCH3），2.81（2H，m，H-7），1.25（3H，d，J＝6.0 Hz，rha-6）；13C-NMR（150 MHz，CD3OD）δ：147.6（C-3），147.4（C-4），133.0（C-1），121.1（C-6），117.1（C-5），112.8（C-2），104.2（glc-1），102.8（rha-1），84.5（glc-3），77.9（glc-5），75.6（glc-2），74.0（rha-4），72.4（rha-3），72.0（C-7），72.2（rha-2），70.2（glc-4），70.1（rha-5），62.7（glc-6），56.5（OMe），36.6（C-8），17.9（rha-6）。与文献［8］报道的darendoside B 一致。

化合物3：白色粉末，易溶于甲醇；TLC 检测有强暗斑，碘蒸熏显黄色，10%硫酸乙醇溶液显色呈紫色。ESI-MSm／z499.2 ［M ＋Na］＋；1H-NMR（500 MHz，CD3OD）δ：6.85（1H，d，J＝1.5 Hz，H-2），6.70（1H，d，J＝8.0 Hz，H-5），6.67（1H，dd，J＝8.0，1.5 Hz，H-6），5.15（1H，d，J＝1.5 Hz，rha-1），4.30（1H，d，J＝8.0 Hz，glc-1），3.84（3H，s，OMe），2.84（2H，td，J＝7.0，2.0 Hz，H-7），1.25（3H，d，J＝6.5 Hz，rha-6）；13C-NMR（150 MHz，CD3OD）δ：148.8（C-3），145.9（C-4），131.6（C-1），122.4（C-6），116.0（C-5），113.7（C-2），104.2（glc-1），102.8（rha-1），84.5（glc-3），77.9（glc-5），75.6（glc-2），74.0（rha-4），72.4（rha-3，C-7），72.2（rha-3，C-7），72.0（rha-2），70.3（rha-5），70.1（glc-4），62.7（glc-6），56.4（OMe），36.8（C-8），17.9（rha-6）。与文献［8］报道的肉苁蓉苷E 一致。

化合物4：白色粉末，易溶于甲醇；TLC 检测有强暗斑，碘蒸熏显黄色，10%硫酸乙醇溶液显色呈紫色。ESI-MSm／z469.2 ［M ＋Na］＋；1H-NMR（500 MHz，CD3OD）δ：7.06（2H，d，J＝8.5 Hz，H-2，6），6.69（2H，d，J＝8.5 Hz，H-3，5），5.15（1H，d，J＝1.5 Hz，rha-1），4.29（1H，d，J＝7.5 Hz，glc-1），2.83（2H，m，H-7），1.25（3H，d，J＝6.5 Hz，rha-6）；13C-NMR（150 MHz，CD3OD）δ：156.8（C-4），130.9（C-6），130.9（C-2），130.7（C-1），116.1（C-5），116.1（C-3），104.2（glc-1），102.8（rha-1），84.5（glc-3），77.9（glc-5），75.6（glc-2），74.0（rha-4），72.4（rha-2），72.2（rha-3），72.1（C-7），70.2（rha-5），70.1（glc-4），62.7（glc-6），36.4（C-8），17.9（rha-6）。与文献［8］报道的肉苁蓉苷G 一致。

化合物5：白色粉末，易溶于甲醇；TLC 检测有强暗斑，碘蒸熏显黄色，10%硫酸乙醇溶液显色呈橘黄色。ESI-MSm／z295.1 ［M ＋Na］＋；1H-NMR（500 MHz，CD3OD）δ：6.98（2H，d，J＝9.0 Hz，H-2，H-6），6.71（2H，d，J＝9.0 Hz，H-3，H-5），4.75（1H，d，J＝7.0 Hz，glc-1），3.90（1H，d，J＝12.0 Hz，H-6′b），3.72（1H，dd，J＝12.5，4.0 Hz，H-6′a）；13C-NMR（150 MHz，CD3OD）δ：153.8（C-1），119.4（C-2，C-6），116.6（C-3，C-5），152.5（C-4），103.7（glc-1），78.1（glc-3），78.0（glc-5），75.0（glc-2），71.5（glc-4），62.6（glc-6）。与文献［9］报道的熊果苷一致。

化合物6：白色粉末，易溶于甲醇；TLC 检测有强暗斑，碘蒸熏显黄色，10%硫酸乙醇溶液显色呈紫色。ESI-MSm／z367.1 ［M ＋Na］＋；1H-NMR（500 MHz，CD3OD）δ：7.63（1H，dd，J＝8.5，2.0 Hz，H-4），7.61（1H，d，J＝2.0 Hz，H-6），7.22（1H，d，J＝8.5 Hz，H-3），5.02（1H，d，J＝7.5 Hz，glc-1），3.90（3H，s，OMe-5），3.89（1H，dd，J＝12.0，2.5 Hz，glc-6a），3.87（3H，s，OMe-7），3.69（1H，dd，J＝12.0，5.5 Hz，glc-6b）；13C-NMR（150 MHz，CD3OD）δ：168.2（C-7），152.2（C-2），150.4（C-5），125.4（C-1），124.5（C-4），116.4（C-3），114.1（C-6），101.9（glc-1），78.3（glc-5），77.8（glc-3），74.7（glc-2），71.2（glc-4），62.4（glc-6），56.7（OMe-5），52.6（OMe-7）。与文献［10］报道的2-O-β-葡萄糖基-5-甲氧基-苯甲酸甲酯一致。

化合物7：白色粉末，易溶于甲醇；TLC 检测有强暗斑，碘蒸熏显黄色，10%硫酸乙醇溶液显色呈紫色。ESI-MSm／z415.1 ［M ＋Na］＋；1H-NMR（500 MHz，CD3OD）δ：7.90（2H，d，J＝8.0 Hz，H-2′，6′），6.94（2H，d，J＝8.0 Hz，H-3，5），6.85（2H，m，H-3′，H-5′），6.60（2H，d，J＝8.0 Hz，H-2，6），4.73（1H，d，J＝7.0 Hz，glc-1），4.66（1H，dd，J＝11.5，2.0 Hz，glc-6b），4.34（1H，dd，J＝11.5，7.5 Hz，glc-6a）；13C-NMR（150 MHz，CD3OD）δ：167.9（C-7′），163.1（C-4′），153.5（C-4），152.3（C-1），132.9（C-2′，C-6′），122.1（C-1′），119.5（C-2，C-6），116.6（C-3，C-5），116.3（C-3′，C-5′），103.6（glc-1），78.0（glc-3），75.6（glc-5），75.0（glc-2），72.1（glc-4），64.4（glc-6）。与文献［11］报道的对羟基苯甲酰基熊果苷一致。

4 肝细胞保护活性研究

将各化合物溶于DMSO中，配成50 mmol／L 母液，采用含1%青霉素-链霉素、10%灭活新生牛血清的DMEM 完全培养基培养HL-7702 细胞，取对数生长期细胞悬液，按3.5×103／孔密度接种至96孔板，每孔100 μL，再将其放在37 ℃、5% CO2、95%空气的培养箱中培养，待细胞贴壁后分为空白组、模型组、给药组，每组设3 个复孔，空白组为含1%新生牛血清的DMEM 完全培养基，模型组为30 mmol／L 对乙酰氨基酚，造模4 h；给药组为30 mmol／L对乙酰氨基酚诱导损伤4 h后，加入不同浓度正丁醇提取物或各化合物。继续孵育24 h后，在显微镜下观察细胞数量及细胞形态，每孔加入5 mg／mL MTT 20 μL，孵育4 h 后终止培养，移除上清液，加入150 μL DMSO，充分振荡混匀，待紫色结晶物充分溶解后用酶标仪在490 nm 测得光密度（OD），计算细胞增殖存活率，公式为存活率＝（给药组平均OD值／空白对照组OD值）×100%；细胞保护率，公式为保护率＝ ［（给药组OD值-模型组OD值）／（空白组OD值-模型组OD值）］×100%；EC50为保护率50%时化合物浓度。

图1 显示，30 mmol／L 对乙酰氨基酚造模4 h时，肝细胞存活率为50%～70%，表明模型较稳定［12］；茺蔚子正丁醇提取物在25～100 μg／mL 质量浓度范围内对受损HL-7702 细胞具有明显保护作用（P＜0.05），在25 μg／mL 时可增加对乙酰氨基酚诱导受损肝细胞的存活率（P＜0.05）。

图1 茺蔚子正丁醇提取物对APAP 损伤的HL-7702 细胞的保护作用Fig.1 Protective effects of n-butanol extract of Leonuri Fructus on APAP-injured HL-7702 cells

再进行肝细胞保护作用筛选，结果见图2。模型组细胞存活率低于空白组（P＜0.01）；化合物1、2、4～6 可不同程度增加对乙酰氨基酚诱导受损肝细胞的存活率，其中4、5 保护作用最显著，在浓度为50 μmol／L 时存活率分别为（101.0±4.16）%、（128.7±4.74）%，EC50分别为（35.71±6.26）、（6.66±0.79）μmol／L。

图2 化合物4、5 对APAP 损伤的HL-7702 细胞的保护作用Fig.2 Protective effects of compounds 4 and 5 on APAP-injured HL-7702 cells

5 讨论

茺蔚子传统用法是以水煎入药，目前报道其水溶性成分主要为氨基酸，而对其他成分的研究较少［13-14］。本实验采用多种色谱分离方法和现代波谱学手段，从茺蔚子正丁醇部位分离鉴定了4 个苯乙醇苷类、3 个酚苷类化合物，其中化合物2、4～7 均为首次从该植物中发现。

茺蔚子、益母草来源于同株植物的不同入药部位，功效有差异［15-16］，前者除具有活血调经的功效外，临床上还用于目赤肿痛或云翳等眼科疾病［17］。本实验对茺蔚子“清泻肝热”的传统功效进行探索，发现其正丁醇部位具有肝细胞保护作用，并发现多个对APAP 损伤的HL-7702 肝细胞具有保护作用成分，可能是该植物药效物质基础。