HPLC-PDA法同时测定补肾强筋丸中5种成分

崔旭辉，李喜香，王雪梅，周婷婷，白兆娟

(1.甘肃中医药大学药学院，甘肃 兰州 730000；2.甘肃省中医院药学部，甘肃 兰州 730050)

补肾强筋丸由山茱萸、续断、白芍、当归等10味药材组成，具有补益肝肾、强筋健骨功效，临床上主要用于治疗地方性骨质疏松型氟骨症，疗效明显[1-2]。方中山茱萸活性成分为马钱苷、莫诺苷[3]，具有抑制软骨细胞凋亡、促进细胞生长、延缓骨关节炎等[4-6]作用；白芍活性成分为芍药苷[3]，具有镇痛、抗炎、抗骨质疏松等[7-9]作用；当归活性成分为阿魏酸[3]，具有抗炎、镇痛、抗成骨细胞凋亡等[10-11]作用；续断活性成分为川续断皂苷Ⅵ[3]，具有抗骨质疏松、抗细胞凋亡等[12-13]作用。

研究表明，单一成分很难全面客观评价中药复方制剂质量[14-15]，前期有学者采用HPLC法对归柏化瘀胶囊中阿魏酸、芍药苷，以及补肾活血方中马钱苷、莫诺苷、芍药苷含量进行测定[16-17]，但检测指标仍较单一。目前，尚未建立补肾强筋丸质量标准，故本实验采用HPLC-PDA法同时测定该制剂中马钱苷、莫诺苷、芍药苷、阿魏酸、川续断皂苷Ⅵ含量，以期为其质量控制提供参考。

1 材料

1.1 仪器 ACQUITY ARC型高效液相色谱仪，配置四元溶剂管理器-R、样品管理器FTN-R、2998PDA检测器(美国Waters公司)；KQ-300DB型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；SECURA125-1CN型十万分之一天平[赛多利斯科学仪器(北京)有限公司]；Elix Essential 5型纯水机(德国默克密理博公司)。

1.2 试剂与药物 补肾强筋丸由甘肃省中医院制剂中心提供(40 g/瓶)，批号分别为 210405、210503、210606。山萸肉(批号200803)、当归(批号190812)、白芍(批号191109)、续断(批号200404)等药材均购自甘肃康乐药业有限责任公司，经甘肃省中医院李喜香主任中药师鉴定为正品，符合2020年版《中国药典》一部项下有关规定。马钱苷(批号P22F10F81444，纯度98%)、莫诺苷(批号P11M11F112846，纯度97%)、阿魏酸(批号L03A9D57744，纯度98%)、川续断皂苷Ⅵ(批号Z19J11L108584，纯度98%)、芍药苷(批号G17A11L111364，纯度98%)对照品均购自上海源叶生物科技有限公司。乙腈为色谱纯(德国默克公司)；其余试剂均为分析纯；水为屈臣氏饮用水(广州屈臣氏食品饮料有限公司)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Waters Sun Fire C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相乙腈(A)-0.1%磷酸(B)，梯度洗脱(0～7 min，5%～6%A；7～8 min，6%～10%A；8～20 min，10%～16%A；20～30 min，16%～20%A；30～32 min，20%～27%A；32～40 min，27%～30%A；40～45 min，30%～34%A；45～50 min，34%～5%A；50～55 min，5%A)；体积流量1.0 mL/min；柱温28 ℃；检测波长212 nm；进样量10 μL。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液 精密称取莫诺苷、马钱苷、阿魏酸对照品适量，置于5 mL量瓶中，甲醇制成质量浓度分别为5.231、2.802、0.360 mg/mL的溶液；精密称取芍药苷、川续断皂苷Ⅵ对照品适量，置于2 mL量瓶中，甲醇制成质量浓度分别为9.306、9.416 mg/mL的溶液。将上述2种溶液混合于同一5 mL量瓶中，甲醇定容，即得(含0.912 mg/mL莫诺苷、0.502 mg/mL马钱苷、1.745 mg/mL芍药苷、0.036 mg/mL阿魏酸、1.788 mg/mL川续断皂苷Ⅵ)。

2.2.2 供试品溶液 取研细的本品3 g，置于具塞锥形瓶中，加入20 mL甲醇，称定质量，超声处理40 min，甲醇补足减失的质量，过0.45 μm微孔滤膜，即得。

2.2.3 阴性样品溶液 按处方工艺制得缺山茱萸、缺白芍、缺当归、缺续断的阴性样品，按“2.3.2”项下方法制备，即得。

2.3 专属性试验 精密吸取对照品、供试品、阴性样品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，结果见图1。由此可知，各成分分离度良好(均大于1.5)，峰形对称，阴性无干扰。

1.莫诺苷 2.马钱苷 3.芍药苷 4.阿魏酸 5.川续断皂苷Ⅵ1.morroniside 2.loganin 3.paeoniflorin 4.ferulic acid 5.asperosaponin Ⅵ图1 各成分HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.4 线性关系考察 精密量取对照品溶液1.0 mL，甲醇稀释5次，分别含莫诺苷28.5、57.0、114.0、228.0、456.0 μg/mL，马钱苷15.7、31.4、62.8、125.5、251.0 μg/mL，芍药苷54.5、109.1、218.1、436.3、872.5 μg/mL，阿魏酸1.12、2.24、4.50、9.00、18.00 μg/mL，川续断皂苷Ⅵ 55.9、111.8、223.5、447.0、894.0 μg/mL，在“2.1”项色谱条件下进样测定。以对照品质量浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)进行回归，结果见表1，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表1 各成分线性关系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.5 方法学考察

2.5.1 精密度试验 取对照品溶液适量，在“2.1”项色谱条件下进样测定6次，测得莫诺苷、马钱苷、芍药苷、阿魏酸、川续断皂苷Ⅵ峰面积RSD分别为2.02%、2.11%、1.67%、1.95%、2.06%，表明仪器精密度良好。

2.5.2 稳定性试验 取同一份供试品溶液，于2、4、6、8、12、24 h在“2.1”项色谱条件下进样测定，测得莫诺苷、马钱苷、芍药苷、阿魏酸、川续断皂苷Ⅵ峰面积RSD分别为1.88%、1.85%、1.72%、2.01%、2.12%，表明溶液在24 h内稳定性良好。

2.5.3 重复性试验 取本品(批号210503)6份，按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，测得莫诺苷、马钱苷、芍药苷、阿魏酸、川续断皂苷Ⅵ含量RSD分别为1.73%、1.44%、1.39%、1.56%、1.93%，表明该方法重复性良好。

2.5.4 加样回收率试验 精密称取各成分含量已知的本品(批号210503)9份，每份1.5 g，每3份为1组，分别按80%、100%、120%水平加入对照品溶液适量，按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，计算回收率。结果，莫诺苷、马钱苷、芍药苷、阿魏酸、川续断皂苷Ⅵ平均加样回收率分别为97.61%、98.71%、99.92%、99.82%、97.66%，RSD分别为1.24%、1.45%、1.21%、1.44%、1.59%。

2.6 样品含量测定 取3批样品，每批3份，按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，计算含量，结果见表2。

表2 各成分含量测定结果(n=3)Tab.3 Results of content determination of various constituents (n=3)

3 讨论

3.1 色谱条件选择 本实验采用190～400 nm全波长扫描，发现马钱苷、莫诺苷在252 nm处有最大吸收，芍药苷在230 nm处有最大吸收，阿魏酸在310 nm处有最大吸收，川续断皂苷Ⅵ在212 nm处有最大吸收，但在212 nm处阿魏酸、芍药苷峰面积相较于最大吸收并无明显差别，而马钱苷、莫诺苷峰面积略微减小，考虑到此处各成分阴性干扰小，可同时将5种成分全部分离，并且峰形良好，故选择212 nm。然后，本实验考察了乙腈-0.1%磷酸、甲醇-0.1%磷酸、乙腈-水等，发现乙腈-0.1%磷酸洗脱时各成分分离效果较好，无拖尾，故以其为流动相。

3.2 供试品溶液制备方法 参考文献[18]报道，本实验首先考察了超声提取、加热回流提取，发现两者提取率无明显差别，但前者效率更高，故选择超声提取。然后，考察了提取溶剂70%甲醇、80%甲醇、甲醇，发现含水甲醇提取时各成分色谱峰峰形较差，而且进样前滤过困难，导致样品损耗大，故选择甲醇。最后，考察了提取时间30、40、60 min，发现提取30 min时提取率较低，提取40、60 min时无明显差异，考虑到效率方面，故选择40 min。

4 结论

本实验首次采用HPLC-PDA法同时测定补肾强筋丸中马钱苷、莫诺苷、芍药苷、阿魏酸、川续断皂苷Ⅵ的含量，该方法简便可靠，重复性好，可用于该制剂质量控制，并为提升其他医院制剂质量及二次开发提供依据。