6S-5-甲基四氢叶酸钙的食用安全性评价

马文斌，薛 娟，涂 华，刘 康，成永之，连增林（通信作者）

（1 北京金康和信药业科技有限公司 北京 100176）

（2 连云港金康和信药业有限公司 江苏 连云港 222000）

叶酸是一种必需的水溶性B 族维生素，自然存在于食物当中，尤其是水果、绿叶蔬菜和肝脏。由于叶酸最早是从植物叶子中提取出来的，是机体内重要的一碳单位共体，可以直接介入人体当中诸多主要的生长过程，如细胞分裂、细胞增殖、胚胎生长及蛋白的合成与代谢。叶酸已经成为一种具备医疗、保健和预防疾病等多功能药物。经研究表明，叶酸能够抑制肿瘤生长、作为产前维生素降低新生儿神经管畸形病变的发生、治疗巨幼红细胞贫血症、影响骨髓中红细胞分裂增殖速度。服用叶酸后能降低人体血清中同型半胱氨酸的水平，减轻内皮细胞损伤，降低脑卒中等心脑血管疾病的发生率。对保护机体健康有着重要意义。6S-5 甲基四氢叶酸是叶酸的主要活性成分，本文旨在探讨食品原料6S-5-甲基四氢叶酸钙的食用安全性，现报道如下。

1.资料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验动物 SD 大鼠，SPF 级，体重180 ～213 g，生产许可证号：SCXK（沪）2013-0016。昆明小鼠，SPF 级，体重19 ～22 g，生产许可证号：SCXK（沪）2013-0006，购买于上海西普尔-必凯实验动物有限公司。标准颗粒饲料饲养，自由饮水。自然昼夜光线照明，相对湿度40%～70%，室温20 ～25 ℃。实验动物使用许可证号：SYXK（沪）2013-0008。动物饲料购买于苏州双狮实验动物饲料科技服务有限公司，登记证号：苏饲审（2009）05032。

1.1.2 受试物 6S-5-甲基四氢叶酸钙（6S-5-MTHF Ca，叶源酸），白色至微黄色粉末，由连云港金康和信药液有限公司提供。

1.1.3 测试菌株 试验菌株TA97、TA98、TA100、TA102购买于美国分子毒理有限公司（MOLECULARTOXICOLOGY，INC.），产品质量保证书批号分别为：458D、4599D、4600D、4604D,通过其生物学特性方面鉴定，试验菌株符合此次实验的要求。

1.1.4 仪器设备 电子秤：ACS-3A 90401582；电子天平：BP310S 9100690；隔水式恒温培养箱：GNP-9270 型104307；电子天平：Sartorius CP124S 13806202；全自动生化仪：7600-010（日本日立）766-7009；血液分析仪：XT-2000i 希森美康66541；台式离心机：Mikro 22（HETTICH 公司）1105；电子天平：Bp3 100 s（沙多里斯公司）91006823；电子秤：ACS-3 型（上海泰和衡器厂）90401570；切片机：HM340E（德国蔡司公司）15782；脱水机：HMP110，（德国蔡司公司）15784；包埋机：AP280（德国蔡司公司）15787；染色机：HMS70（德国蔡司公司）15788。

1.2 方法

1.2.1 急性毒性实验 选择体重符合实验要求的SD大鼠、昆明小鼠，雌、雄，雌、雄各10 只，将雌、雄SD 大鼠、昆明小鼠分别放入鼠笼内，实验前，雌、雄大鼠不禁水，禁食16 h 以后，实验方法根据最大耐受量试验原则指导，雌、雄大鼠称重，灌胃容量按20 mL/kg BW计，相应剂量的供试液通过经口灌胃方式给予各组实验动物，灌胃给药每次间隔4 h，24 h 内分3 次灌胃，动物染毒后，每周对动物称重1 次。观察动物体重变化、精神状态、反应性、毛发色泽、饮食、排泄状况、中毒表现和死亡只数等，观察周期为1 周。实验全过程中如遇死亡动物或到期处死的动物，及时进行实体解剖，通过肉眼观察，将有病理改变的动物组织器官情况均做详细记录。

1.2.2 骨髓细胞微核试验 选择体重合适的雌、雄性昆明小鼠，按体重随机分为5 组，每组10 只，雌雄参半。供试液设定：1.25 g/kg、2.5 g/kg 和5.0 g/kg 组，另设阳性对照组（环磷酰胺40 mg）和溶剂对照组，雌、雄昆明小鼠逐只称重，灌胃容量按0.4 mL/20 g·bw 计，相应剂量的样本通过经口灌胃方式给予各组实验动物，灌胃给药采用30 h 2 次灌胃法，分别对各组动物灌胃。末次灌胃给药后6 h，采用颈椎脱臼处死动物，对股骨骨髓进行取材，然后，加入小牛血清冲洗混匀，冲洗物移至载玻片上，均匀推片，干燥、干燥后放入甲醇中固定5 ～10 min，取出，晾干，涂片用Giemsa 染色20 min，蒸馏水冲洗后待检。显微镜油镜观察下，逐只先进行计数1 000 个嗜多染红细胞（PCE）的微核数，微核率通常以千分率表示，再计数嗜多染红细胞（计数200 个PCE）时同时计数成熟红细胞（NCE）数，并计算PCE/NCE值。

1.2.3 小鼠精子畸形实验 选择体重合适的雄性昆明小鼠，按体重随机分为5 组，每组5 只。供试液设定：1.25 g/kg、2.5 g/kg 和5.0 g/kg 组，另设阳性对照组（环磷酰胺40 mg）和溶剂对照组，雌、雄昆明小鼠逐只称重，灌胃容量按0.4 mL/20 g·bw 计，相应剂量的样本通过经口灌胃方式给予各组实验动物，连续5 d，每日灌胃给药1 次。第1 次灌胃给药后，第35 天采用颈椎脱臼处死动物，将两侧附睾取材后，放入0.9%氯化钠溶液中，冲洗，剪碎，四层纱布过滤，取滤液至载玻片上涂片，甲醇固定5 min，2%伊红水溶液染色制片，室温干燥。高倍镜下观察，逐鼠计数1 000 个精子的畸形数，并详细记录畸形类型。

1.2.4 Ames 试验 从液氮罐中取出一株菌株制作成主平板，准备15 mL/瓶营养肉汤，将分离好的单菌落悬浮其中。实验菌液浓度控制在1.1 ～1.6×10/mL，温度控制37 ℃ 120 次/分振荡暗培养12 h。本次试验按GB15193.4-2003 中鼠伤寒沙门氏菌/哺乳动物微粒体酶试验中平板掺入法进行，依次向保温的45 ℃ 2 mL 顶层培养基中加入0.1 mLl 受试物和0.1 mL 菌株增菌液，需活化时，向板中加入0.5 mL S9 混合液，并且充分混匀迅速颠倒底层平板，实验需要做3 个平行平板。37 ℃培养48 h，计数每皿中的回变菌落数，试验重复1 次。

1.3 统计学方法

2.结果

2.1 大鼠急性毒性试验

试验期间大鼠未见明显不良反应，观察剖检主要脏器未见肉眼可见病变。最大耐受剂量＞15 g/kg，属无毒级，见表1。

表1 大鼠急性经口毒性试验结果

2.2 小鼠急性毒性试验

试验期间各组未见任何不良反应和死亡动物，所有小鼠均表现正常饮食饮水，毛色光泽良好；实验结束，处死动物，通过肉眼观察每只动物的脏器组织，未见异常。样品经口灌胃给药的雌、雄小鼠，在急性经口毒性试验中，最大耐受剂量MTD 均＞15 g/kg，属无毒级，见表2。

表2 小鼠急性经口毒性试验结果

2.3 骨髓细胞微核试验

受试物各组剂量组PCE/NCE 比值、微核率与阴性对照组相比，差异无统计学意义（＞0.05），且受试物组PCE 占RBC 总数的比例不少于对照组的20%，提示受试物对小鼠骨髓细胞无抑制作用。经统计学分析，6S-5-甲基四氢叶酸钙（L-5-MTHF Ca）骨髓嗜多染红细胞微核试验结果为阴性，见表3。

表3 动物骨髓嗜多染红细胞微核发生率

2.4 小鼠精子畸形试验

与溶剂对照组相比较，受试物各剂量组精子畸形率比较，差异无统计学意义（＞0.05），该受试物无致小鼠畸形作用，见表4。

表4 动物精子畸形发生率

2.5 Ames 试验（致突变试验）

在本次实验条件下的2 次试验中，在加和不加用S9活化系统平板掺入法检测的条件下，各剂量组的回复菌落数均低于溶剂对照组的2 倍，故认为：该受试物的Ames 试验检测结果为阴性，见表5。

表5 第1 次试验测试结果

3.讨论

叶酸在人体内无法自身合成，需要通过外界补充获取，一般在机体内处于结合状态，且血浆中含量很低。只有单次口服剂量达到250 μg 时，血浆中才会出现游离的叶酸，6S-5 甲基四氢叶酸是叶酸的主要活性成分，其可以透过血脑屏障，预防老年痴呆、细胞贫血等症状。随着研究深入，叶酸还有许多其他的治疗用途，尽管这些用途不如前面提到的那么有效。叶酸可以预防溃疡性结肠炎的肿瘤形成，防止宫颈发育不良，治疗白癜风，恢复因叶酸缺乏而引起的大细胞贫血的造血功能，增加牙龈对局部刺激物的抵抗力，从而减少炎症反应。为了造福人类，提高生活质量，我们以《食品安全性毒理学评价程序和方法》GB15193-2003 有关规定作为根据，对6S-5 甲基四氢叶酸钙进行了安全性毒理学评价，以此证明该产品作为保健食品开发的可行性安全性依据。

本文结果显示，样品对雌雄大、小鼠的经口的最大耐受剂量MTD 均＞15 g/kg，属于无毒级。遗传毒性实验中，Ames 试验、小鼠骨髓细胞微核试验、试验结果均为阴性；生殖毒性试验中，小鼠精子畸形试验结果为阴性，表明6S-5 甲基四氢叶酸钙对体细胞无致突变性。因此可以初步认为在本次试验的条件下6S-5 甲基四氢叶酸钙作为药品和食品使用是安全可靠的。