不同木薯品种主要根系分泌物提取与鉴定

韩笑　杨慰贤　覃锋燕　范晓苏　黎亮武　黄凯　阳太亿　申章佑　韦茂贵

摘  要：本研究通過对木薯根系分泌物进行提取、分离与鉴定，探究不同木薯品种根系分泌物的差异，为筛选抗化感耐连作木薯新种质提供参考。以木薯组培苗琼脂培养基为试验材料，采用正交试验设计，结合GC-MS技术考察不同萃取材料和洗脱剂对木薯根系分泌物的提取和分离效果，选择最优方案测定‘新选048’‘南植199’和‘华南205’的根系分泌物。结果表明：（1）木薯根系分泌物水溶性物质提取的最优方案为：用去离子水超声提取捣碎的琼脂培养基30 min，固液分离后用XAD-2萃取、无水乙醇洗脱，浓缩后用GC-MS检测，成功鉴定出包括有机酸类、醇类、酯类、酮类、醛类等26种有机化合物。（2）醇溶性物质提取的最优方案为：用50%乙醇超声提取捣碎的琼脂培养基30 min，固液分离后用XAD-4萃取、无水乙醇洗脱，浓缩后用GC-MS检测，鉴定出包括有机酸类、醚类、酯类、酮类、醛类等15种有机化合物。（3）不同品种根系分泌物的水溶性和醇溶性成分均有差异。‘南植199’根系分泌物的主要水溶性物质有羟乙酸甲酯（相对含量为3.72%）、羟基丙酮（2.40%）、甲肼（1.79%）等，主要醇溶性物质有乙醇醛（18.89%）、羟基丙酮（2.47%）、甲酸（2.25%）等;‘新选048’的主要水溶性物质有甲酸（2.68%）、1，5-戊二醇（2.39%）、丙烯酸羟乙酯（2.01%）等，主要醇溶性物质有乙醇醛（17.00%）、甲酸（2.62%）、羟基丙酮（2.46%）等;‘华南205’的主要水溶性物质有甲酸（2.23%）、羟基丙酮（1.80%）、羟乙酸甲酯（1.43%）等，主要醇溶性物质有乙醇醛（16.58%）、甲酸（3.06%）、八氟戊醇（2.98%）等。不同木薯品种的根系分泌物种类和含量均有差异，从而导致其抗化感耐连作能力的差异，为筛选耐连作品种缓解木薯连作障碍成为可能。

关键词：木薯;根系分泌物;化感作用;有机酸;GC-MS中图分类号：S533      文献标识码：A

Extraction and Characterization of Root Exudates of Different Ca­ssava Varieties

HAN Xiao YANG Weixian QIN Fengyan FAN Xiaosu LI Liangwu HUANG Kai YANG Taiyi SHEN Zhangyou WEI Maogui

1. College of Agriculture， Guangxi University， Nanning， Guangxi 530004， China; 2. Economic Crop Research Institute， Guangxi Academy of Agricultural Sciences， Nanning， Guangxi 530004， China; 3. Guangxi Key Laboratory of Agro-Environment and Agro-Product Safety， Nanning， Guangxi 530004， China

Autotoxicity caused by the auto-toxicity of root exudates has been proved as one of the most important reasons for continuous cropping obstacle. Root exudates of many plant types have been characterized. However， specific components of cassava root exudates have not been explored. The current study focused on the comparative effects for using different materials and eluants during the extraction and the separation processes of cassava root exudates. Then the best approach for extraction and characterization of the compounds of cassava root exudates were applied for analysing the root exudates of cassava varieties ‘XX048’ ‘NZ199’ and ‘SC205’. The optimal protocol for extraction of water-soluble substances of cassava root exudates can be described as follows： the agar medium was extracted within distilled water for 30 minutes using ultrasonic waves， after the solid-liquid separation process， the compounds in the filtrate was adsorpted with XAD-2， then eluted by ethanol， and analyzed by the gas chromatography-mass spectrometry （GC-MS）. In total， twenty-six water-soluble substances were identified. Meanwhile， the optimal protocol for extraction of ethanol-soluble substances of cassava root exudates were as follows： the agar medium was extracted within 50% ethanol for 30 minutes using ultrasonic waves， the compounds in the filtrate were adsorpted with XAD-4 and then eluted also by ethanol. Fifteen compounds were identified by GC-MS. Furthermore， the dominating water-soluble substances in root exudates of cassava variety ‘NZ199’ were methyl hydroxyacetate （the relative content was 3.72%）， hydroxyacetone （2.40%） and methylhydrazine （1.79%）， and the main alcohol-soluble substances of ‘NZ199’ were ethanol aldehyde （18.89%）， hydroxyacetone （2.47%） and formic acid （2.25%）. For ‘XX048’， the main water-soluble substances were formic acid （2.68%）， 1，5-pentanediol （2.39%） and hydroxyethyl acrylate （2.01%）， while the main alcohol-soluble substances were ethanol aldehyde （17.00%）， formic acid （2.62%） and hydroxyacetone （2.46%）. For ‘SC205’， the main water-soluble substances were formic acid （2.23%）， hydroxyacetone （1.80%） and methyl hydroxyethylate （1.43%）， while the main alcohol-soluble substances were ethanol aldehyde （16.58%）， formic acid （3.06%） and octafluoropentanol （2.98%）. Thus， the chemical substances and the relative contents of root exudates varied with genotypes， leading to different resistant abilities of cassava varieties for continuous cropping obstacle.

cassava; root exudates; allelopathy effect; organic acid; GC-MS

10.3969/j.issn.1000-2561.2022.06.018

木薯（Crantz），又名树薯，大戟科植物，是世界七大作物之一。木薯块根不仅是热带及亚热带地区低收入农民的重要粮食，还是生产淀粉、乙醇的原料和饲料。木薯常年连作会导致根际土壤微生物结构发生改变，细菌数量增多，真菌数量减少，土壤肥力下降，从而导致木薯产量下降。连作障碍已成为我国木薯单产下降的主要因素。因此，研究木薯连作障碍的形成机制及其缓解措施对提高木薯单产具有重要意义。

自毒作用是作物连作障碍形成的关键原因之一，根系分泌物是自毒物质的主要来源之一。已成功鉴定出花生、芝麻、人参等作物根系分泌物的成分，然而不同作物根系分泌物的成分及含量是不同的，目前木薯根系分泌物种类及其作用机理尚未报道。袁飞等研究了木薯根系分泌物及其土壤浸出液对橡胶树2种致病菌的化感效果，但未明确木薯根系分泌物的组分。植物根系分泌物成分复杂且含量低，加上土壤成分復杂，故直接从土壤中分离鉴定根系分泌物难度较大。现阶段，收集根系分泌物的方法有溶液培收集法、基质培收集法、土培收集法等，用琼脂培养基收集根系分泌物是基质培收集法之一，能有效避免土壤其他物质成分及土壤微生物的干扰，操作简单方便。根系分泌物的提取溶剂主要为甲醇、水、乙醇等，曲赛男研究发现用50%乙醇提取黄瓜根系分泌物的酚酸物质效果比纯水或乙醇提取效果更好。根系分泌物分离的方法有溶剂萃取法、树脂法、层析法、分子膜和超速离心法等，树脂法是目前较新的一种分离方法，具有吸附速度快、容易洗脱等优点。根系分泌物检测的方法有生物活性测定方法和仪器分析方法，仪器有液相色谱仪^[14]、离子色谱、气相色谱-质谱联用仪（GC-MS）、核磁共振仪等。气质联用仪是目前常用于检测根系分泌物的一种方法，具有进样量小、灵敏度高等特点。

根系分泌物的收集、分离纯化和鉴定的方法多种多样，却缺乏权威、统一、有效的方法。此外，不同植物的根系分泌物不同，同一作物不同品种根系分泌物的成分及含量也有差异。因此，有必要检测不同木薯品种的根系分泌物，识别不同品种相应的自毒物质。故本研究以木薯组培苗琼脂培养基为试验材料，采用正交试验设计考察不同的提取剂、固相萃取材料和洗脱剂对琼脂培养基中根系分泌物的提取效果，结合GC-MS技术探究提取、分离与鉴定木薯根系分泌物的最优方法。进而采用最优方法检测3个不同抗性木薯品种的根系分泌物，识别其相应的自毒物质，为下一步系统研究木薯自毒作用机理和筛选耐连作木薯新种质提供技术支撑。

 材料与方法

材料

试验于2019年10月—2020年6月在广西大学进行。根据前人研究结果，选择不耐连作木薯品种‘南植199’（NZ199）、抗性一般的品种‘华南205’（SC205）和较耐连作品种‘新选048’（XX048）为组培苗试验材料。用MS琼脂培养基获得无菌苗后，参照曾文丹等的方法，用1/2MS琼脂培养基促根，继代培养60 d后，琼脂培养基备用。收集1/2MS空白琼脂培养基32瓶，分2次用破壁机捣碎，然后充分搅拌混匀，作为对照;每个品种随机选择32瓶，共收集96瓶琼脂培养基，分次捣碎后搅拌混匀，用于木薯根系分泌物提取条件优化试验;每个品种随机取15瓶琼脂培养基，分次捣碎后搅拌混匀，用于不同品种根系分泌物差异试验。

  方法

1.2.1  木薯组培苗根系分泌物提取试验设计  木薯根系分泌物的收集包含“提取—萃取—洗脱”3个重要环节。由于木薯根系分泌物既有水溶性物质也有醇溶性物质，故本研究选取去离子水和50%乙醇2种提取剂，4种固相萃取材料分别是大孔吸附树脂XAD-2（美国ROHM & HAAS公司）、大孔吸附树脂XAD-4（美国ROHM & HAAS公司）、反向填料PEP-2（天津博纳艾杰尔科技有限公司）和纤维素DEAE（合肥博美生物科技有限责任公司），洗脱剂为无水乙醇和2%乙酸-甲醇。乙醇、甲醇、乙酸等其他药剂均为分析纯。采用正交试验设计构建16种不同条件的试验方案（表1），每个方案设1个对照和3次重复。

1.2.2  木薯组培苗根系分泌物的收集  参照曲赛男和李忠等的方法，根据表1中的试验方案，以1/2MS琼脂培养基作为对照，分别称取含有3个品种根系分泌物的混合琼脂培养基68 g（含水量为97.1%，折算干物质为2 g），加入提取剂超声30 min，抽滤、离心，取上清液，固相萃取材料萃取，2次上样，洗脱剂150 mL洗脱，收集洗脱液，减压浓缩至干，复溶于5 mL甲醇（色谱纯，纯度99.9%）中，得到混合根系分泌物样品，于–20℃条件下保存备用。每个试验设1个对照和3次重复。

1.2.3  根系分泌物测定及最优方案确定  取混合根系分泌物样品1.5 mL，过0.22 μm有机滤膜，在Agilent 7890A-5975C型气相色谱-质谱联用仪（美国Agilent公司）上进行化学成分分析。测试条件参照李忠等的方法进行设置。将GC-MS图谱信息与NIST MS Search 2.0谱库核对，确定各组分物质的结构及名称。其中，某方案3次重复均能测出的物质扣除对照中测出的物质，即为该方案检测出的物质。以检出的有机物化合物种类最多的方案确定为最优方案。

1.2.4  不同木薯品种根系分泌物的测定  以1/2MS琼脂培养基为对照，取各品种捣碎混匀的琼脂培养基作为材料，根据根系分泌物提取条件优化试验确定的最优方案，分别提取和测定不同品种根系分泌物中的水溶性物质和醇溶性物质。具体过程参照1.2.2和1.2.3。

数据处理

用峰面积归一化法计算GC-MS图谱中各组分的相对含量。采用Microsoft Excel 2016、Microsoft PowerPoint 2016软件进行数据整理及图表绘制。

结果与分析

木薯根系分泌物提取最优条件的确定

根据16种提取方案，共获得64个GC-MS图谱。以去离子水为提取剂的各个方案中，经检测发现，方案ABC提取的水溶性物質种类最多，提取效果最好（图1），其中，对照中检测出13种成分，重复1检测出45种成分，重复2和重复3均检测出47种成分。3个重复均能检测出的化合物共有39种，扣除对照中的13种物质，方案ABC共检出26种有机化合物，远高于以去离子水为提取剂的其他方案。因此，采用方案ABC提取后续试验中3个木薯品种组培苗的水溶性根系分泌物。

以50%乙醇为提取剂的各个方案中，方案ABC提取的根系分泌物质数量最多，提取效果最好（图2），对照中检出12种成分，重复1和重复2均检测出31种成分，重复3检测出46种成分。3个重复均能检测出的化合物共有27种，扣除对照中的12种物质，方案ABC共检出15种有机化合物，高于以50%乙醇为提取剂的其他方案。因此，采用方案ABC提取后续试验中3个木薯品种组培苗的醇溶性根系分泌物。

 木薯根系分泌物的主要成分与组成

2.2.1  水溶性物质种类鉴定  对方案ABC提取的木薯根系分泌物水溶性物质种类进行GC-MS测定，成功分离鉴定出26种木薯根系分泌物水溶性物质，平均相对含量大于1%的有机化合物见表2，包含有机酸类、醇类、酯类、酮类、醛类等。其中，对照中没有检出但样品中检出的成分有羟基丙酮（1.37%）、乙醇醛二聚体（2.17%）、甲酸（1.97%）、硝酸异山梨酯（2.52%）、N，N-二甲基甲酰胺二丙基缩醛（1.82%）等。此外，若物质同时在对照及样品中检出，且在样品中的相对含量较大，也可能是木薯根系分泌物的成分。这类物质包括乙醇醛、乙酸、1，3-二羟基丙酮二聚体、2，4-二叔丁基苯酚、邻苯二甲酸二丁酯等。

2.2.2  醇溶性物质种类鉴定  对方案ABC提取的木薯根系分泌物醇溶性物质进行GC-MS测定，分离鉴定出15种木薯根系分泌物醇溶性物质，平均相对含量大于1%的化合物见表3，包含有机酸类、醚类、酯类、酮类、醛类等。其中，对照中没有检出但样品中检出的成分有5种，分别是羟基丙酮（1.85%）、乙醇醛（6.69%）、乙醇醛二聚体（2.04%）、甲酸（2.20%）、N，N'-二乙酰基乙二胺（1.63%）。而同时在对照及样品中检出，且在样品中的相对含量较大的物质有1，3-二羟基丙酮二聚体、4H-pyran-4-one、2，3-dihydro-3， 5-dihydroxy-6-methyl-等。

 不同木薯品种根系分泌物的鉴定

2.3.1  主要水溶性物质鉴定  以最优方案ABC体系分别提取‘南植199’‘华南205’‘新选048’的根系分泌物，利用GC-MS分离鉴定各品种的根系分泌物水溶性化合物种类，共鉴定出80种成分，其中相对含量大于1%的主要化学成分见表4。其他因含量较低或者因某个峰峰面积太大而导致附近的峰未能确定的种类有40种（图3）。

不同木薯品种的根系分泌物水溶性成分种类和含量均有差异（表4）。‘南植199’的主要水溶性根系分泌物有羟乙酸甲酯（3.72%）、羟基丙酮（2.40%）、甲肼（1.79%）等;‘新选048’中检测出的主要成分有甲酸（2.68%）、1，5-戊二醇（2.39%）、丙烯酸羟乙酯（2.01%）等;‘华南205’的主要成分有甲酸（2.23%）、羟基丙酮（1.80%）、羟乙酸甲酯（1.43%）等。3个木薯品种组培苗根系分泌物水溶性物质中共有的组分为羟基乙酸甲酯、丙烯酸羟乙酯、羟基丙酮和butanenitrile， 2，3-dioxo-，dioxime，o，o'-diacetyl-四种;甲肼为‘南植199’特有组分，1，5-戊二醇为‘新选048’特有组分。

2.3.2  主要醇溶性物质鉴定  选择最优方案A2B2C1分别提取‘南植199’‘华南205’‘新选048’琼脂培养基中的根系分泌物醇溶性物质，最终鉴定出64种成分，相对含量大于1%的主要化学成分见表5。其他因含量较低或者因某个峰峰面积太大而导致附近的峰未能确定种类的有34种（图4）。

不同木薯品种根系分泌物醇溶性成分种类和相对含量也有差别（表5），‘南植199’根系分泌物的主要醇溶性物质有乙醇醛（18.89%）、羟基丙酮（2.47%）、甲酸（2.25%）等;‘新选048’的主要醇溶性物质有乙醇醛（17.00%）、甲酸（2.62%）、羟基丙酮（2.46%）等;‘华南205’的主要醇溶性物质有乙醇醛（16.58%）、甲酸（3.06%）、八氟戊醇（2.98%）等。3个木薯品种组培苗根系分泌物醇溶性物质中共有的组分为甲酸、羟基乙酸甲酯、丙烯酸羟乙酯、（+/–）-3-羟基-r-丁内酯、乙醇醛、羟基丙酮、1，2-benzenedi­carboxylic acid， butyl 2-methylpropyl ester、L- talose， 6-deoxy-3-C-methyl-2-O-methyl-，且乙醇醛的相对含量比较高;八氟戊醇和sec-butyl nitrite为‘华南205’的特有组分。

讨论

用琼脂培养基收集根系分泌物能排除土壤杂质和微生物的干扰，得到最初的根系分泌物，是常见收集根系分泌物的方式之一，在豌豆、大蒜、白三叶等植物根系分泌物收集上均获得成功。树脂吸附法是常用的分离纯化根系分泌物的方法之一，适用于分离根系分泌物中的有机物、阴阳离子或极性分子，采用该方法已成功分离花生、百合等植物的根系分泌物。气质联用仪是常用于检测根系分泌物的仪器之一，采用GC-MS技术分析根系分泌物已在马铃薯、人参等植物中得到应用。本研究通过构建不同的试验体系提取木薯组培苗琼脂培养基中的根系分泌物，确定了以琼脂培养基收集，树脂吸附法纯化分离根系分泌物为基础，结合GC-MS技术鉴定根系分泌物的最佳提取分离、鉴定条件，成功识别了不同木薯品种根系分泌物中的化合物种类与数量。

已报道的根系分泌物种类包含有机酸、醇、醛、酮、烃类及其衍生物等低分子有机化合物。谭雪莲利用大田中采集的马铃薯植株的根际土来提取根系分泌物，氮吹浓缩，氯仿萃取，加N，O-双（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺反应1 h，用GC-MS进行分析，鉴定出棕榈酸、硬脂酸、邻苯二甲酸二丁酯、N，N-二乙基乙酰胺等化感物质，并明确了棕榈酸、硬脂酸和邻苯二甲酸二丁酯的化感效应。吴凤芝等从甘蔗的腐烂残株中鉴定出甲酸、乙酸、草酸、丙二酸等化感物质。张允等用豌豆组培苗、土培苗，用水提取，二氯甲烷萃取，二氯甲烷溶解定容，经GC-MS鉴定，提取出醇类、脂类、醛类、苯类、烃类等有机化合物，并明确了2，4-二叔丁基苯酚（2，4-DB）和2，6-二叔丁基对甲酚（2，6-DM）的化感效应。已报道的化感物质棕榈酸、硬脂酸、邻苯二甲酸二丁酯、乙酸、2，4-DB等，在本研究中也检测到，这几种物质是否为木薯主要根系分泌物，是否对木薯生长产生影响，有待进一步研究。本研究以木薯为研究对象，检测出主要根系分泌物有羟乙酸甲酯、羟基丙酮、乙醇醛、甲酸、甲肼、1，5-戊二醇、八氟戊醇等。其中，甲肼僅在‘南植199’中检出，1，5-戊二醇仅在‘新选048’中检出，八氟戊醇仅在‘华南205’中检出，而这3种物质是否分别为3个木薯品种的自毒物质仍有待验证。

因同一种作物不同品种根系分泌物的种类与相对含量有所差异，随着该品种连作年限的增加，根系分泌物在土壤中不断累积，从而表现出不同程度的连作障碍。‘华南205’是广西多年主栽品种，稳产性好，故其耐连作特性相对较好;‘新选048’高产高抗，能耐一定年限的连作;‘南植199’属于良种，淀粉产量高，但抗性相对较弱。连作引起根系分泌物的有机酸富集，可以显著加速土壤中磷的溶解。当豆蔻酸、软脂酸和硬脂酸的混合物在土壤中累积到较高浓度时，会抑制花生植株的生长。木薯连作势必造成根系分泌物中的有机酸富集，土壤pH下降。由于不同品种中的有机酸种类及含量不一致，其对土壤中磷溶解的影响程度不同，这可能是不同品种表现出耐连作能力差异的主要原因，‘新选048’和‘华南205’分泌较多的甲酸和乙酸，其活化土壤磷能力较强，植株能吸收更多的磷元素，刺激木薯幼苗根系发育，促使茎秆变得更粗壮，从而缓解连作造成的植株生长不良等影响。而‘南植199’的棕榈酸相对含量较高，在连作时引起棕榈酸富集导致植株的生长受到抑制，故其表现出较严重的连作障碍。

本研究采用组培的形式收集根系分泌物，与大田复杂的土壤环境相比差距较大，故木薯大田连作中，根系分泌的低分子有机酸和脂肪酸的种类和含量对木薯生长的影响规律仍有待深入研究。因为木薯种子较难获取，本研究未能进行种子发芽试验，尚无法直接验证鉴定出的化合物对不同木薯品种的化感作用，仍有待作进一步研究。

 结论

木薯根系分泌物的提取、分离与鉴定的结果，随着提取剂、固相萃取材料等的不同，检测出的物质有一定差异。使用去离子水提取的物质有醇类、有机酸类、酯类、酮类、醛类等26种有机化合物，使用50%乙醇提取的物质包括有机酸类、醚类、酯类、酮类、醛类等15种有机化合物。

3个木薯品种根系分泌物的水溶性和醇溶性成分及相对含量均有所差异。‘南植199’的水溶性根系分泌物主要有羟乙酸甲酯、羟基丙酮、甲肼等，相对含量分别为3.72%、2.40%、1.79%;其醇溶性根系分泌物主要有乙醇醛、羟基丙酮、甲酸等，相对含量分别为18.89%、2.47%、2.25%。‘新选048’的水溶性根系分泌物主要有甲酸、1，5-戊二醇、丙烯酸羟乙酯等，相对含量分别为2.68%、2.39%、2.01%;其醇溶性根系分泌物主要有乙醇醛、甲酸、羟基丙酮等，相对含量分别为17.00%、2.62%、2.46%。‘华南205’的水溶性根系分泌物主要有甲酸、羟基丙酮、羟乙酸甲酯等，相对含量分别为2.23%、1.80%、1.43%;其醇溶性根系分泌物主要有乙醇醛、甲酸、八氟戊醇等，相对含量分别为16.58%、3.06%、2.98%。不同木薯品种检测出的特有物质是否会造成木薯品种耐连作能力的差异，有待进一步研究。

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