张 刚,何丽珊,王小平,2*
(1.漳州卫生职业学院 药学系,福建 漳州 363000;2.漳州卫生职业学院 漳州市现代中药重点实验室,福建 漳州 363000)
白芍为毛茛科植物芍药(Paeonia lactifloraPall.)的干燥根,味苦、酸,性微寒,归肝、脾经,具有养血调经、敛阴止汗、柔肝止痛、平抑肝阳的功效[1].常见的白芍炮制品种有生白芍、醋白芍、酒白芍、炒白芍、土炒白芍和焦白芍[2].生白芍能较大限度地保留白芍水溶性浸出物和醇溶性浸出物含量[3],敛阴平肝作用较强,常用于肝阳上亢所致的眩晕、头痛、耳鸣等;酒炙能降低白芍酸寒之性,使白芍更擅于和中缓急、止痛,常用于腹痛,胁肋疼痛[4];醋炙可缓和白芍药性,降低毒性[5],主人肝收敛,可敛血止血、疏肝解郁;炒白芍长于养血和肝,常用于肝旺脾虚之症;土炒白芍用于肝阳脾虚泄泻或泻痢日久,喜按喜温;焦白芍养血柔肝,缓中止痛、敛阴收汗、治胸腹胁肋疼痛、泻痢腹痛、自汗盗汗、阴虚发热[6-7].
现代化学和药理学研究表明,白芍总苷是白芍及其炮制品的有效部位,主要含芍药苷、苯甲酰芍药苷、氧化芍药苷、芍药内酯苷等一系列单萜糖苷类化合物,为白芍及其炮制品的药效物质基础[8-9],也是白芍及其炮制品质量控制的主要指标.目前,白芍及其炮制品质量控制的方法主要有高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)法、毛细管电泳法、近红外光谱法、紫外分光光度计法[10]、超高效液相色谱与四级杆-线性离子阱串联质谱联用技术(UPLC-Q-Trap MS-MS)[11]等,其中HPLC法以操作简便、分离度和检测灵敏度高、重现性较好等优点,成为目前测定芍药苷含量使用率最高的方法[12].
本研究采用HPLC法对白芍饮片及其5种炮制品中芍药苷、苯甲酰芍药苷、氧化芍药苷、芍药内酯苷4种成分含量进行测定,研究不同炮制方法对白芍中主要单萜糖苷类药效物质含量的影响,为白芍及其炮制品质量控制提供参考.
岛津高效液相色谱仪(LC-20AD二元泵、SPD-M20A光电二极管阵列紫外可见检测器、AQ-C18色谱柱);XSE205DU电子天平(梅特勒-托利多,上海);KQ-250DE 型超声波清洗器(昆山超声仪器).
芍药苷(批号:MUST-19110118),苯甲酰芍药苷(批号:MUST-20032310),氧化芍药苷(批号:MUST-20052801),芍药内酯苷(批号:MUST-20041601),以上4 种对照品均购于成都曼思特生物科技有限公司;乙腈(色谱纯,Merck 公司),磷酸(色谱纯,Fisher 公司),甲醇(色谱纯,Fisher 公司);由普力菲尔精密型超纯水机(上海富诗特仪器设备有限公司)制备超纯水,其他试剂均为分析纯;白芍购于江西江中中药饮片有限公司,经漳州卫生职业学院药学系王小平教授鉴定为毛莨科植物芍药(Paeonia lactiflora Pall.)干燥的根.样本存放于漳州卫生职业学院漳州市现代中药重点实验室.
白芍饮片购于江西江中中药饮片有限公司.不同白芍炮制品制备方法如下.
酒白芍:取白芍片100 g,加入黄酒10 g,拌匀,稍闷至酒被吸干后置炒制容器内,用文火加热,炒至微黄,取出放凉[1].醋白芍:取白芍片100 g,加米醋20 g,拌匀,稍闷至醋被吸干后置炒制容器内,用文火加热,炒干,取出放凉[13].炒白芍:取白芍片置炒制容器内,用文火加热,炒至表面微黄色,取出放凉[1].土炒白芍:取20 g 灶心土置炒制容器内,用中火加热,炒至土星呈灵动状态,加入100 g 白芍片,翻炒至药物表面挂土粉,并微显焦黄色时,取出药物,筛除土粉,放凉[13].焦白芍:取白芍片置炒制容器内,先用武火后用文火炒至表面黑褐色,内深褐色,取出放凉[14].
对照品溶液制备:精密称定对照品芍药苷、苯甲酰芍药苷、氧化芍药苷和芍药内酯苷,分别置于5 mL容量瓶中,用乙腈(30%)和0.1%磷酸水(70%)混合液定容制备浓度分别为0.506 0、0.540 0、0.506 0 和0.552 0 mg·mL-1的对照品储备液.再分别精密移取上述对照品储备液,配制芍药苷、苯甲酰芍药苷、氧化芍药苷和芍药内酯苷混合对照品溶液.
供试品溶液制备:将干燥的生白芍、酒白芍、醋白芍、炒白芍、土炒白芍和焦白芍粉碎,过180 μm(80目)筛.再精密称定上述6种粉末各1.0 g,分别置于100 mL具塞三角烧瓶中,然后各加入75%的甲醇溶液50 mL后称重,超声处理(功率200 W)30 min后取出,放至室温后用75%的甲醇溶液补足失重.摇匀后用普通中性滤纸过滤,再用0.45 μm滤膜真空抽滤,取抽滤滤液作为供试品溶液.
Shimadzu GL InertSustain AQ-C18液相色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm),流动相:0.1%磷酸水(A)-乙腈(C);梯度洗脱程序:0~5 min(C 为10%~16%),5~20 min(C 为16%~16%),20~35 min(C 为16%~20%),35~45 min(C 为20%~24%),45~60 min(C 为24%~48%);流速:1.0 mL·min-1;柱温:35 ℃;进样量:10 μL;检测波长:230 nm(芍药苷、苯甲酰芍药苷和芍药内酯苷)和258 nm(氧化芍药苷).
2.1.1 线性关系考察 精密量取混合对照品溶液1.00、2.00、4.00、6.00、8.00、10.00 mL,分别置于10 mL容量瓶中,用75%的甲醇溶液稀释至刻度,摇匀,参考1.5色谱条件分别进样,以对照品溶液峰面积为纵坐标,浓度为横坐标,绘制工作曲线,进行回归分析.结果见表1.在线性范围内相关系数(r)均大于0.999,说明回归方程线关系良好.
表1 4种单萜糖苷类对照品化合物的回归方程
2.1.2 精密度试验 按1.5 色谱条件对同一浓度对照品混合溶液连续重复进样6 次,每次进样量为10 μL,记录峰面积.结果芍药苷、苯甲酰芍药苷、氧化芍药苷和芍药内酯苷面积的相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)分别为0.72%、0.51%、0.43%和0.54%,4 种成分峰面积的RSD 均小于1.80%,表明仪器精密度良好.
2.1.3 重复性试验 精密称定1.0 g 白芍粉末6 份,按1.4 制备6 份平行样,按1.5 色谱条件进行检测.记录峰面积,计算白芍粉末中芍药苷、苯甲酰芍药苷、氧化芍药苷和芍药内酯苷含量分别为30.548、0.635、0.198 和4.153 mg·g-1,RSD 分别为1.41%、1.12%、1.06%和1.24%,4 种成分含量测定的RSD 值均小于1.50%,表明该方法具有良好的重复性.
2.1.4 稳定性试验 精密称定1.0 g白芍粉末,按1.4制备供试品溶液,按1.5色谱条件,在第0、12、24、36和48 h 进行检测.结果芍药苷、苯甲酰芍药苷、氧化芍药苷和芍药内酯苷面积的RSD 分别为2.24%、1.81%、1.67%和1.77%,4种成分峰面积的RSD值均小于3.00%,表明供试品溶液在48 h内基本稳定.
2.1.5 加样回收率试验 精密称定已知含量的炒白芍粉末6份,分别加入样品含量相当的4种对照品溶液,按照1.4进行提取和制备,依据1.5色谱条件进行测定,计算结果如表2.芍药苷、苯甲酰芍药苷、氧化芍药苷和芍药内酯苷平均加样回收率分别为99.67%、96.13%、94.25%和99.00%,RSD 分别为0.29%、4.80%、2.61%和1.07%,平均回收率和RSD值均在药典规定的可接受范围内.
表2 加样回收率试验结果
从图1 可知,炮制方法对样品中4种单萜糖苷类化合物的含量影响有显著差异.对照品(S7)与待测品HPLC(S1~S6)图谱均可见芍药苷和芍药内酯苷色谱峰,说明白芍生品及上述5 种炮制品中芍药苷和芍药内酯苷均有相对较丰富的含量;而苯甲酰芍药苷和氧化芍药苷色谱峰在土炒白芍(S5)和焦炒白芍(S6)HPLC图谱中不明显,表明这2种成分含量较少,经过土炒和焦炒后损失较大.
图1 混合对照品和6种白芍样品的高效液相色谱图
从表3可以看出,不同炮制方法对4种单萜糖苷类化合物的含量影响差别较大,其中酒炙、醋炙和清炒影响较小,4 种单萜糖苷类化合物含量变化不大.而经过土炒和焦炒后上述4 种化合物含量都有不同程度的减少,芍药内酯苷含量减少了四分之一,氧化芍药苷和苯甲酰芍药苷含量不足生品中含量的三分之一,芍药苷含量则不足生品中含量的四分之一.
表3 不同白芍炮制品测量结果
中药炮制是依照中医辨证施治用药的需要和药物自身性质、以增强药物疗效、改变药物性能、减除毒性或副作用等为目的所采取的制药技术.明代御医陈嘉谟在《本草蒙筌》中记载:“凡药制造,贵在适中,不及则功效难求,太过则气味反失……酒制升提,姜制发散.入盐走肾脏,用醋注肝经,乳制滋润回枯,助生阴血,蜜制甘缓难化”[15].不同中药炮制品疗效的差别主要源于炮制过程中其化学组成的变化,比较和研究中药炮制前后和不同炮制品主要成分的变化,对研究中药炮制作用和原理具有重要的意义.
本研究中,白芍、炒白芍、酒白芍和醋白芍中芍药苷的含量均在2.8%以上,远大于2020 年版《中华人民共和国药典》中对生白芍、炒白芍和酒白芍中芍药苷的含量均不得低于1.2%的要求.上述4种白芍炮制品中丰富的白芍总苷含量,使其在心血管疾病治疗[16-17]、抗抑郁[18]、保肝[19]、镇痛、抗炎、肠胃道疾病治疗[20]、抗肿瘤[21-22]和抗氧化[23]等方面均有广泛的应用前景.随着炮制温度的升高,土炒和焦炒炮制品中芍药苷含量急剧减少,尤其是焦白芍中,芍药苷含量不足白芍生品中含量的10%,说明芍药苷对炮制温度敏感,随温度升高含量降低,这与前人的研究一致[24].高温焦炒使焦白芍具有“敛血止血”的功效[25],但本研究尚不能确定焦白芍中止血活性物质,根究中药炮制“炒炭存性”的标准要求[26],需要进一步开展研究工作,以明确白芍焦炒前后可能存在的止血活性成分的变化规律,为揭示焦白芍发挥敛血止血功效的炮制机制提供参考.