银杏叶提取物通过JAK2/STAT3信号通路调控食管癌细胞EC9706增殖、凋亡、侵袭、迁移的研究

照日格吐，孙志刚，焦杰，刘悦

[1.内蒙古自治区人民医院胸外科，内蒙古 010020；2.湖北文理学院附属医院（襄阳市中心医院）消化内科，湖北襄阳 441021]

食管癌是临床常见的消化道恶性肿瘤。外科手术是早期患者主要的治疗方法，中晚期患者以放化疗为主，但效果欠佳，且毒副作用会加重患者痛苦；中医药治疗可帮助食管癌患者术后的调理和恢复，并能配合西医，改善患者的生活质量、延长生命，且毒副作用小，有相辅相成之效[1-4]。银杏叶提取物是从银杏叶中提取的有药理活性的混合物，主要成分包括黄酮类、萜内脂类、有机酸类等，具有保护神经系统、抗氧化和抗肿瘤等作用[5-6]。有研究报道银杏叶提取物能诱导乳腺癌MCF-7 细胞凋亡，抑制肿瘤细胞增殖[7]；还可能通过抑制核转录因子-κB（nuclear factor-κB, NF-κB）信号通路抑制神经胶质瘤U87 细胞的增殖和侵袭，促进细胞凋亡[8]；可能通过抑制胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinases, ERK）/NF-κB/基质金属蛋白酶-2（matrix metalloproteinase, MMP-2）信号通路抑制胃癌的侵袭转移[9]。然而银杏叶提取物对食管癌细胞的增殖、侵袭、迁移、凋亡的影响及机制尚不清楚。

信号转导子和转录激活子3（signal transducer and activator of transcription 3, STAT3）是一种细胞内重要的转录因子，在体内可被其最常见的上游激酶——酪氨酸激酶（tyrosine kinase, JAK）磷酸化激活，JAK/STAT3 信号通路的异常活化能促进肿瘤的发生、发展，JAK/STAT3 信号通路的靶向抑制剂可抑制肿瘤发展[10-11]。有研究[12]报道LINC01535 通过激活JAK/STAT3 通路促进食管鳞状细胞癌增殖并抑制凋亡。还有研究报道缺血性脑卒中后银杏叶提取物可通过抑制JAK2/STAT3 通路抑制星形胶质细胞脂质2（lipocalin-2, LCN2）表达并减轻神经炎症损伤[13]。然而银杏叶提取物是否通过JAK2/STAT3 信号通路影响食管癌细胞的增殖、凋亡、侵袭、迁移尚不清楚。基于此，本实验研究银杏叶提取物对食管癌细胞EC9706 的增殖、凋亡、侵袭、迁移的影响及其机制是否与JAK2/STAT3 信号通路有关，为中药治疗食管癌提供参考。

1 材料与方法

1.1 细胞、试剂和仪器

食管癌细胞EC9706 购自上海北诺生物科技有限公司。胎牛血清、RPMI 1640 培养基购自美国Gibco 公司，银杏叶提取物（纯度> 98%）购自上海彩佑实业有限公司，白细胞介素-6（Interleukin-6,IL-6）购自上海沪震实业有限公司，RIPA 蛋白裂解液、二辛可宁酸（BCA）试剂盒、细胞计数试剂盒8（CCK-8）购自北京凯瑞基生物科技有限公司，膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素（Annexin V-FITC）/碘化丙锭（PI）凋亡检测试剂盒购自上海信裕生物科技有限公司，Transwell 小室、Matrigel 胶购自美国BD 公司，一抗、二抗购自武汉维诺赛生物技术有限公司。CytoFLEX 流式细胞仪购自贝克曼库尔特公司。

1.2 细胞处理与分组

食管癌细胞EC9706 用含10%胎牛血清的RPMI 1640 培养液在37℃、5%二氧化碳培养箱培养，取对数生长期细胞进行实验。将EC9706 细胞以每孔10×104个细胞接种到6 孔板中，每孔体积100 μL，分别用100 mg/L、200 mg/L、400 mg/L 的银杏叶提取物培养，记为不同浓度银杏叶提取物组，用等量基础培养液培养的细胞作为对照组，用400 mg/L银杏叶提取物和20 ng/mL IL-6 培养的细胞为银杏叶提取物+IL-6 组。

1.3 CCK-8法检测细胞增殖活性

对照组，100 mg/L、200 mg/L、400 mg/L 银杏叶提取物组，银杏叶提取物+ IL-6 组，5 组细胞以2×104个/孔接种在6 孔板中，细胞培养48 h，每孔添加10 μL CCK-8 溶液，在酶标仪450 nm 波长处检测光密度（OD）值，代表细胞增殖活性。

1.4 流式细胞术检测细胞凋亡

对照组，100 mg/L、200 mg/L、400 mg/L 银杏叶提取物组，银杏叶提取物+IL-6 组，5 组细胞以2×104个/孔接种在6 孔板中，细胞培养48 h，室温下1 000 r/min 离心5 min，收集细胞；用预冷的PBS重悬细胞2 次，1 000 r/min 离心5 min，洗涤细胞；加入300 μL 的1×Binding Buffer 悬浮细胞；重悬后加入10 μL Annexin V-FITC，混匀后4℃避光孵育10 min， 再加入5 μL PI， 避光染色5 min。CytoFLEX 流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.5 Western blotting 检测Ki-67、Cleavedcaspase-3、MMP-2、MMP-9、p-JAK2、p-STAT3蛋白相对表达量

细胞裂解液提取对照组，100 mg/L、200 mg/L、400 mg/L 银杏叶提取物组，银杏叶提取物+IL-6 组的细胞总蛋白，用BCA 试剂盒定量。分别取50 μL 各组蛋白，煮沸10 min 变性后，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，电泳结束后通过电转移法将蛋白质转移至PVDF 膜上，封闭1 h；分别加稀释的一抗，4℃孵育过夜，次日取出PVDF 膜，PBST 充分漂洗（5 min×3 次），加入稀释的二抗，室温孵育60 min，PBST 充分漂洗（5 min×3 次）后，加入化学发光试剂显影。β-actin 为内参。用Image J 软件分析各蛋白条带的灰度值，蛋白相对表达量=目的条带/β-actin条带。其中，100 mg/L、200 mg/L、400 mg/L 银杏叶提取物组检测Ki-67、Cleaved-caspase-3 蛋白相对表达量；对照组、400 mg/L 银杏叶提取物组、银杏叶提取物+IL-6 组检测MMP-2、MMP-9、p-JAK2、p-STAT3 蛋白相对表达量。

1.6 Transwell实验检测细胞迁移和侵袭

采用8.0 μm 聚碳酸酯膜Transwell 小室进行实验。迁移实验：对照组、400 mg/L 银杏叶提取物组、银杏叶提取物+IL-6 组细胞用无血清培养基以1×104个/mL 的密度悬浮，将100 μL 悬浮液添加到上室，将600 μL 含血清的RPMI 1640 培养液添加到下室，温育48 h 后，用棉签小心地擦去聚碳酸酯膜表面上未迁移的细胞；4%多聚甲醛固定30 min，0.1%结晶紫染色30 min，用PBS 轻轻清洗2 次。倒置显微镜下观察细胞计数。侵袭实验：用Matrigel胶包被Transwell 小室的上室，其余与细胞迁移实验步骤相同。

1.7 统计学方法

数据分析采用SPSS 20.0 统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较行t检验或方差分析，进一步两两比较用LSD-t检验。P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组EC9706细胞OD值比较

对照组，100 mg/L、200 mg/L、400 mg/L 银杏叶提取物组，银杏叶提取物+IL-6 组，5 组细胞的OD 值分别为（1.246±0.08）、（1.015±0.09）、（0.602±0.05）、（0.418±0.04）及（1.108±0.11），5 组比较，经方差分析，差异有统计学意义（F=181.344，P=0.000）；进一步两两比较，与对照组比较，不同浓度银杏叶提取物组EC9706 细胞的OD 值均降低（P<0.05），细胞活性降低，且呈浓度依赖性；银杏叶提取物+IL-6 组与400 mg/L 银杏叶提取物组比较，银杏叶提取物+IL-6组EC9706 细胞活性升高（t=17.895，P=0.000）。见图1。

图1 各组EC9706细胞OD值的比较

2.2 各组EC9706细胞凋亡率的比较

对照组，100 mg/L、200 mg/L、400 mg/L 银杏叶提取物组，银杏叶提取物+IL-6 组，5 组的细胞凋亡率分别为（6.29±0.52）%、（10.03±0.91）%、（19.12±1.72）%、（25.09±2.13）%及（9.13±0.82）%，5 组比较，经方差分析，差异有统计学意义（F=301.217，P=0.000）。进一步两两比较，与对照组比较，不同浓度银杏叶提取物组EC9706 细胞凋亡率升高（P<0.05），且呈浓度依赖性；银杏叶提取物+IL-6 组与400 mg/L 银杏叶提取物组比较，银杏叶提取物+ IL-6 组EC9706 细胞凋亡率降低（t=21.639，P=0.000）。见图2。

图2 各组EC9706细胞凋亡的流式细胞图

400 mg/L 银杏叶提取物能显著抑制EC9706 细胞增殖和促进细胞凋亡，故选取400 mg/L 银杏叶提取物为后续实验浓度。

2.3 各组细胞Ki-67、Cleaved-caspase-3、MMP-2、MMP-9、p-JAK2、p-STAT3 蛋白相对表达量的比较

对照组，100 mg/L、200 mg/L、400 mg/L 银杏叶提取物组，银杏叶提取物+IL-6 组细胞的Ki-67、Cleaved-caspase-3 蛋白相对表达量比较，经方差分析，差异有统计学意义（P<0.05）。进一步两两比较，100 mg/L、200 mg/L、400 mg/L 银杏叶提取物组Ki-67 蛋白相对表达量较对照组均降低（P<0.05），银杏叶提取物+IL-6 组Ki-67 蛋白相对表达量较400 mg/L 银杏叶提取物组升高（t=23.255，P=0.000）；100 mg/L、200 mg/L、400 mg/L 银杏叶提取物组Cleaved-caspase-3 蛋白相对表达量较对照组均升高（P<0.05），银杏叶提取物+ IL-6 组Cleavedcaspase-3 蛋白相对表达量较400 mg/L 银杏叶提取物组降低（t=15.363，P=0.000）。对照组、400 mg/L银杏叶提取物组、银杏叶提取物+ IL-6 组细胞MMP-2、MMP-9、p-JAK2、p-STAT3 蛋白相对表达量比较，经方差分析，差异有统计学意义（P<0.05）。进一步两两比较，400 mg/L 银杏叶提取物组较对照组均降低（P<0.05），银杏叶提取物+IL-6 组较400 mg/L 银杏叶提取物组均升高（P<0.05）。见图3、4 和表1、2。

图3 对照组及不同浓度银杏叶提取物组细胞Ki-67、Cleaved-caspase-3、MMP-2、MMP-9、p-JAK2、p-STAT3蛋白的表达

图4 400 mg/L银杏叶提取物组与银杏叶提取物+IL-6组细胞Ki-67、Cleaved-caspase-3、MMP-2、MMP-9、p-JAK2、p-STAT3蛋白的表达

表1 各组细胞Ki-67、Cleaved-caspase-3蛋白相对表达量的比较 （±s）

表1 各组细胞Ki-67、Cleaved-caspase-3蛋白相对表达量的比较 （±s）

注：①与对照组比较，P<0.05；②与100 mg/L 银杏叶提取物组比较，P <0.05；③与200 mg/L 银杏叶提取物组比较，P <0.05；④与400 mg/L银杏叶提取物组比较，P<0.05。

Cleaved-caspase-3 0.29±0.02 0.39±0.03①0.62±0.05①②0.79±0.07①②③0.37±0.03④200.719 0.000组别对照组100 mg/L银杏叶提取物组200 mg/L银杏叶提取物组400 mg/L银杏叶提取物组银杏叶提取物+IL-6组F 值P 值Ki-67 0.92±0.09 0.82±0.08①0.52±0.05①②0.35±0.03①②③0.88±0.06④130.856 0.000

表2 3组细胞MMP-2、MMP-9、p-JAK2、p-STAT3蛋白相对表达量的比较 （±s）

表2 3组细胞MMP-2、MMP-9、p-JAK2、p-STAT3蛋白相对表达量的比较 （±s）

注：①与对照组比较，P<0.05；②与400 mg/L银杏叶提取物组比较，P<0.05。

组别对照组400 mg/L银杏叶提取物组银杏叶提取物+IL-6组F 值P 值p-STAT3 0.72±0.07 0.32±0.03①0.65±0.06②131.075 0.000 MMP-2 0.86±0.08 0.42±0.04①0.82±0.08②111.000 0.000 MMP-9 0.78±0.06 0.30±0.03①0.70±0.06②220.444 0.000 p-JAK2 0.80±0.07 0.42±0.04①0.79±0.07②111.079 0.000

2.4 3组EC9706细胞迁移数和细胞侵袭数的比较

对照组、400 mg/L 银杏叶提取物组及银杏叶提取物+ IL-6 组EC9706 细胞迁移数、细胞侵袭数比较，差异有统计学意义（P<0.05）；进一步两两比较，400 mg/L 银杏叶提取物组EC9706 细胞迁移数、细胞侵袭数较对照组减少（t=19.004 和15.264，均P=0.000），银杏叶提取物+ IL-6 组EC9706 细胞迁移数、细胞侵袭数较400 mg/L 银杏叶提取物组增多（t=18.264 和10.619，均P=0.000）。见表3和图5。

表3 3组EC9706细胞迁移数和细胞侵袭数的比较（个，±s）

表3 3组EC9706细胞迁移数和细胞侵袭数的比较（个，±s）

组别对照组400 mg/L银杏叶提取物组银杏叶提取物+IL-6组F 值P 值细胞迁移数152.22±13.15 61.02±5.86 141.06±11.23 200.428 0.000细胞侵袭数112.43±10.08 56.49±4.39 96.06±9.14 109.255 0.000

图5 3组EC9706细胞的迁移和侵袭 （倒置显微镜×200）

3 讨论

中医药在防治食管癌术后的并发症、减轻放化疗的毒副作用等方面起重要作用，能延长患者的生存期、提高患者的生活质量，提高患者的综合治疗效果[14-16]。有研究[17]报道银杏叶提取物能够抑制甲状腺癌细胞的增殖、侵袭、迁移能力，还能通过调控凋亡相关蛋白p53、Bcl-2、Bax 的表达而促进细胞凋亡，且呈现浓度依赖性。银杏叶提取物还可通过调控PI3K/Akt 信号通路抑制甲状腺癌TPC-1 细胞株的增殖[18]。银杏叶提取物可抑制小鼠黑素瘤B16 细胞增殖，使细胞周期阻滞于G0/G1期，并诱导细胞凋亡[19]。银杏叶提取物可能通过抑制蛋白激酶B（protein kinase B, Akt）和p38 丝裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinases, p38 MAPK）通路下调热休克蛋白27（heat-shock protein 27, HSP27）的表达，从而降低非小细胞肺癌细胞系A549 和H441 的迁移能力[20]。本研究结果显示，不同浓度银杏叶提取物组食管癌细胞EC9706 与对照组比较，Ki-67、MMP-2、MMP-9 蛋白表达降低，Cleavedcaspase-3 蛋白表达升高，细胞活性降低，细胞凋亡率升高，细胞迁移数和细胞侵袭数降低。表明银杏叶提取物可抑制食管癌细胞EC9706 增殖、侵袭、迁移，并促进细胞凋亡。

JAK/STAT3 信号通路是细胞信号通路中重要的信号传导通路之一，对细胞凋亡和增殖有关键作用，影响肿瘤的发生发展[21]。有研究[22]表明中医药可通过调节JAK/STAT3 信号通路影响肿瘤的进展，如姜黄素可以通过抑制JAK/STAT3 信号通路促进骨巨细胞瘤的凋亡，抑制其迁移、侵袭。竹节香附素通过抑制JAK/STAT3 信号转导通路抑制人子宫内膜癌HEC-1-B 细胞的侵袭转移[23]。黄芪多糖可能通过沉默JAK2/STAT3/c-myc 信号通路抑制口腔鳞癌细胞SCC-25 移植瘤的生长[24]。本研究结果显示，银杏叶提取物处理的食管癌细胞EC9706 中p-JAK2、p-STAT3 蛋白表达降低，这提示银杏叶提取物可抑制JAK2/STAT3 信号通路的激活。有研究[25]表明IL-6可激活JAK/STAT3 信号通路，因此本研究用IL-6 和银杏叶提取物同时作用食管癌细胞EC9706，研究激活JAK/STAT3 信号通路是否影响银杏叶提取物对食管癌细胞EC9706 的作用。本研究结果显示，经过IL-6 处理后，EC9706 细胞活性升高，凋亡率降低，细胞迁移数、细胞侵袭数增多，表明IL-6 可以逆转银杏叶提取物对EC9706 细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭的影响。经过IL-6 处理后，细胞中Ki-67、MMP-2、MMP-9 蛋白表达均升高，Cleaved-caspase-3、p-JAK2、p-STAT3 蛋白表达均降低，表明IL-6 可通过激活JAK2/STAT3 信号通路作用于食管癌细胞EC9706。

综上所述，银杏叶提取物可能通过阻断JAK2/STAT3 信号通路抑制食管癌细胞EC9706 增殖、侵袭、迁移，促进细胞凋亡。