SFBR联合贝伐珠单抗对结肠癌脉管系统的影响*

岳宏程，祝德，许加华，何海林，张洪洋，岳兴家，张建文，熊良庚

（1.巴中市中心医院肿瘤科，四川巴中 636000；2.西南医科大学附属医院肿瘤科，四川泸州 646000；3.重庆市巴南区人民医院肿瘤科，重庆 401320）

结肠癌是我国常见的恶性肿瘤[1]，该肿瘤组织中微血管（Microvessel, MV）、淋巴管（lymphatic vessel, LV）、血管生成拟态（vasculogenic mimicry,VM）等脉管系统丰富，肿瘤通过其获取营养，并发生侵袭和转移。贝伐珠单抗为传统的抗血管生成分子靶向药物，其通过抑制肿瘤MV 生成，从而阻断肿瘤血液供应，达到抑制肿瘤生长的目的。但贝伐珠单抗对LV、VM 无效。肿瘤对贝伐珠单抗的敏感性随治疗时间的延长逐渐降低。探索抑制结肠癌的综合治疗方式成为当前结肠癌治疗的研究热点。放疗联合贝伐珠单抗在乳腺癌、大脑胶质瘤的治疗中获得了理想的疗效，毒副作用较轻[2-3]。但尚未见二者联合治疗结肠癌的报道。本实验通过复制结肠癌移植瘤模型，观察单次近距离放疗（singlefraction brachytherapy, SFBR）联合贝伐珠单抗对结肠癌脉管系统和肿瘤生长的影响，为结肠癌治疗方案的设计提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

结肠癌CT26 细胞株由西南医科大学附属医院肿瘤科提供；BALB/c 小鼠36 只，雌性，4～5 周龄，体重16～22g，购自重庆腾鑫华阜实验动物销售有限公司（合格证编号：11401300024918），饲养于西南医科大学附属医院肿瘤科动物房；Ir192三维后装近距离治疗机（荷兰Nucletron 公司）；贝伐珠单抗注射液（山东齐鲁制药有限公司，规格：100 mg/4 mL）；抗小鼠CD31、D2-40 单克隆抗体、过碘酸-雪夫（PAS）染色试剂盒（美国Bio World 公司）。

1.2 方法

1.2.1 模型复制及处理取对数生长期的CT26 细胞接种于BALB/c 小鼠右侧后腿皮肤，约8～10 d 后成瘤（可以触及直径约5 mm 瘤结节）。成瘤后隔天检查移植瘤生长状态，测量移植瘤长短径，计算其体积（V）。待移植瘤直径达8～10 mm 时将小鼠随机分为4 组。①空白对照组：经尾静脉注射生理盐水0.2 mL，注射1 d；②SFBR 组：将放疗插植针沿肿瘤长轴插入肿瘤内，对小鼠进行CT 扫描，并勾画靶区GTV，制定放疗计划。连接后装放疗机，释放放射源进入插植针中，对肿瘤进行近距离放疗，剂量（Dt）=10 Gy/F×1 d。③贝伐珠单抗组：经尾静脉注射贝伐珠单抗5 mg/kg，0.2 mL，注射1 d。④联合组：在同一天分别进行SFBR 和贝伐珠单抗的注射，方法同前。治疗后第14 天处死小鼠，剥去肿瘤，切取部分肿瘤组织用于流式细胞术检测，其余部分立即用10%中性甲醛溶液固定，常规石蜡包埋、切片，用于免疫组织化学检测。

1.2.2 移植瘤体积检测从肿瘤接种后第10 天开始，每2 天测量小鼠移植瘤的长径（a）与短径（b），按公式计算移植瘤体积：V=1/2（a×b2），并求各组肿瘤体积平均值。待移植瘤直径达8～10 mm 时将小鼠随机分组并进行治疗，治疗后第14 天计算肿瘤生长抑制率（tumor growth inhibition rate, TGIR）。TGIR=（对照组肿瘤V-实验组肿瘤V）/对照组肿瘤V×100%。

1.2.3 肿瘤最大标准摄取值（maximum standard up‐take value，SUVmax）检测先通过尾静脉注射利多卡因将小鼠麻醉，再进行18F-FDG micro PET/CT 扫描（电压80 kV；电流500 μA；层距1.5 mm）。采用2D FBP 重建技术获取肿瘤18F-FDG 分布融合图像并计算SUVmax。

1.2.4 肿瘤微血管密度（microvessel density,MVD）检测按免疫组织化学SP 法进行CD31 染色，结果由两位高年资的病理医师在光学显微镜下进行判读，内皮细胞染成棕黄色或棕褐色的管腔结构为肿瘤MV，每张切片随机选取5 个高倍视野，计数每个视野MV 个数，计算5 个视野MV 的平均值即为MVD。

1.2.5 肿瘤淋巴管密度（lymphatic vessel density,LVD）检测按免疫组织化学SP 法进行D2-40 染色，结果由两位高年资的病理医师在光学显微镜下进行判读，内皮细胞染成棕黄色或棕褐色的管腔结构为肿瘤LV，每张切片随机选取5 个高倍视野，计数每个视野LV 个数，计算5 个视野LV 的平均值即为LVD。

1.2.6 肿瘤血管生成拟态密度（vasculogenic mimicry density, VMD）检测先按免疫组织化学SP 法进行CD31 染色，再用浓度为0.5%的过碘酸氧化10 min，蒸馏水清洗后，用雪夫液（PAS）于避光条件下染20 min，吸取0.5%偏重亚硫酸钠冲洗2 次，每次持续2 min。结果由两位高年资的病理医师在光学显微镜下进行判读，VM 为CD31 阴性而PAS 阳性（红色）的管腔结构。每张切片随机选取5 个高倍视野，计数每个视野VM 个数，计算5 个视野VM 的平均值即为VMD。

1.2.7 肿瘤细胞Ki-67阳性表达率检测按免疫组织化学SP 法进行Ki-67 染色，结果由两位高年资的病理医师在光学显微镜下进行判读，细胞核呈黄色或棕黄色为Ki-67 阳性细胞，每张切片随机选取5 个高倍视野，计数每个视野Ki-67 阳性细胞占该视野肿瘤细胞的比例，计算5 个视野Ki-67 阳性细胞所占比例的平均值，即为肿瘤细胞Ki-67 阳性表达率。

1.2.8 肿瘤细胞凋亡率检测取新鲜的肿瘤组织研磨、离心制成悬浮液。悬浮液中加入200 μL 的Binding Buffer 缓冲液，调整细胞密度为1×106个/mL。吸取195 μL 细胞悬液到流式细胞管中，向管中加入5 μL Annexin V-FITC 试剂。5 min 后向管中加入10 μL 碘化丙啶（PI）试剂，室温下避光孵育10 min。孵育结束后向流式细胞管中加入300 μL 无菌PBS液，当管中液体充分混匀后将流式细胞管放置流式细胞仪上检测。

1.3 统计学方法

数据分析采用SPSS 17.0 统计软件。计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用单因素方差分析或重复测量设计的方差分析，进一步两两比较用LSD-t检验。P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 治疗后不同时间点各组小鼠移植瘤体积比较

治疗后不同时间点小鼠移植瘤体积比较，采用重复测量设计的方差分析，结果：①不同时间点的移植瘤体积有差异（F=11 813.804，P=0.000）。②各组的移植瘤体积有差异（F=398.226，P=0.000），联合组移植瘤体积最小。③各组移植瘤体积在不同时间点的变化趋势有差异（F=393.829，P=0.000）。见表1和图1。

表1 治疗后不同时间点各组小鼠移植瘤体积的比较 （n=8，mm3，±s）

表1 治疗后不同时间点各组小鼠移植瘤体积的比较 （n=8，mm3，±s）

组别空白对照组SFBR组贝伐珠单抗组联合组0 d 309.25±12.45 312.25±13.06 316.13±12.83 315.62±13.96 2 d 588.13±26.16 535.38±20.49 577.75±23.35 480.63±24.73 4 d 827.25±23.41 712.25±24.95 797.63±35.74 517.25±37.24 6 d 1 178.13±37.77 968.75±31.90 1 073.38±43.01 688.38±38.98组别空白对照组SFBR组贝伐珠单抗组联合组8 d 1 543.88±46.33 1 167.75±37.23 1 278.38±41.52 742.38±50.47 10 d 1 790.13±47.31 1 364.88±42.32 1 529.37±49.50 901.25±55.11 12 d 2 053.75±40.66 1 478.63±47.87 1 621.88±47.39 1 096.38±62.37 14 d 2 247.75±36.13 1 734.87±74.14 1 705.63±52.83 1 192.25±56.30

图1 各组肿瘤体积随时间的变化趋势

2.2 各组小鼠移植瘤终体积、TGIR及SUVmax的比较

各组小鼠移植瘤终体积比较，经单因素方差分析，差异有统计学意义（F=428.948，P=0.000），联合组移植瘤终体积小于SFBR 组和贝伐珠单抗组（P<0.05），SFBR 组与贝伐珠单抗组间无差异（P>0.05）。各治疗组TGIR 比较，经单因素方差分析，差异有统计学意义（F=180.086，P=0.000），联合组TGIR 高于SBRT 组和贝伐珠单抗组（P<0.05），SFBR组与贝伐珠单抗组间无差异（P>0.05）。各组SUVmax阳性表达率比较，经单因素方差分析，差异有统计学意义（F=46.586，P=0.000），联合组SUVmax低于SFBR 组和贝伐珠单抗组（P<0.05），SFBR 组与贝伐珠单抗组之间无差异（P>0.05）。见表2和图2。

表2 各组移植瘤终体积、TGIR及SUVmax比较（n=8，±s）

表2 各组移植瘤终体积、TGIR及SUVmax比较（n=8，±s）

注：①与空白对照组比较，P<0.05；②与SFBR组比较P<0.05；③与贝伐珠单抗组比较，P<0.05。

终体积/mm3 2 247.75±36.13 1 734.88±74.14①1 705.63±65.86①1 192.13±52.20①②③428.948 0.000 SUVmax 3.87±0.34 3.46±0.36①3.62±0.32 2.11±0.27①②③46.586 0.000组别空白对照组SFBR组贝伐珠单抗组联合组F 值P 值TGIR/%-22.82±3.30 24.12±2.93 46.96±2.32②③180.086 0.000

图2 各组18F-FDG micro PET/CT扫描图

2.3 各组移植瘤组织MVD、LVD及VMD比较

各组移植瘤组织MVD 比较，经单因素方差分析，差异有统计学意义（F=39.269，P=0.000），联合组MVD 低于SFBR 组和贝伐珠单抗组（P<0.05），贝伐珠单抗组MVD 低于SFBR 组（P<0.05）。各组移植瘤组织LVD 比较，经单因素方差分析，差异有统计学意义（F=39.587，P=0.000），联合组LVD 低于SFBR 组和贝伐珠单抗组（P<0.05），SFBR 组LVD 低于贝伐珠单抗组（P<0.05）。各组移植瘤组织VMD比较，经单因素方差分析，差异有统计学意义（F=23.789，P=0.000）。联合组VMD 低于SFBR 组和贝伐珠单抗组（P<0.05），SFBR 组VMD 低于贝伐珠单抗组（P<0.05）。见表3和图3、4。

表3 各组移植瘤组织MVD、LVD及VMD比较（n=8，个/视野，±s）

表3 各组移植瘤组织MVD、LVD及VMD比较（n=8，个/视野，±s）

注：①与空白对照组比较，P<0.05；②与SFBR组比较P<0.05；③与贝伐珠单抗组比较P<0.05。

VMD 6.38±1.41 3.50±1.19①5.75±1.04②2.38±0.52①②③23.789 0.000组别空白对照组SFBR组贝伐珠单抗组联合组F 值P 值MVD 12.63±1.69 10.38±1.51①8.63±1.41①②4.75±1.39①②③39.269 0.000 LVD 10.13±1.25 7.25±1.28①9.00±1.07②3.75±1.38①②③39.587 0.000

图3 各组移植瘤组织脉管系统比较

图4 各组脉管系统表达情况

2.4 各组移植瘤细胞Ki-67阳性表达率比较

各组移植瘤细胞Ki-67 阳性表达率比较，经单因素方差分析，差异有统计学意义（P<0.05），联合组Ki-67 表达率低于SFBR 组和贝伐珠单抗组（P<0.05），SFBR 组低于贝伐珠单抗组（P<0.05）（见表4和图5）。各组细胞凋亡率比较，经单因素方差分析，差异有统计学意义（P<0.05）。联合组肿瘤细胞凋亡率高于SFBR 组和贝伐珠单抗组（P<0.05），SFBR 组高于贝伐珠单抗组（P<0.05）（见表4和图6）。

图6 各组细胞凋亡率比较

表4 各组移植瘤细胞Ki-67阳性表达率及凋亡率比较(n=8，%，±s）

表4 各组移植瘤细胞Ki-67阳性表达率及凋亡率比较(n=8，%，±s）

注：①与空白对照组比较，P<0.05；②与SFBR组比较P<0.05；③与贝伐珠单抗组比较P<0.05。

组别空白对照组SFBR组贝伐珠单抗组联合组F 值P 值Ki-67阳性表达率83.13±6.81 46.25±7.06①73.00±6.82①②26.13±8.89①②③96.493 0.000凋亡率2.11±0.18 4.22±0.24①3.53±0.30①②6.68±0.28①②③455.767 0.000

3 讨论

结肠癌的治疗是以手术治疗为主，辅以化疗、放疗及靶向治疗的综合治疗。结肠癌易发生脉管转移，术后5年生存率仅为50%左右。传统的外照射治疗结肠癌，由于放疗时间长，肿瘤周围正常器官受到的照射剂量高，放疗后不良反应重[4]。近距离放疗是近年来受到广泛关注的新型放疗技术。它将放射源直接放置到肿瘤组织内部，在提高肿瘤放射剂量的同时，周围的正常组织接受的放射剂量却大大降低，有效地保护了周围正常器官[5]，放疗相关不良反应明显减少[6-7]。目前近距离放疗已广泛应用于前列腺癌、乳腺癌、妇科肿瘤的治疗[8]。

肿瘤MV 不仅向肿瘤供应营养物质，其内皮细胞分泌的降解酶还可诱导肿瘤细胞进入MV 向远处转移。肿瘤组织中LV 与MV 呈交联短路式生长，这种结构有利于肿瘤发生LV 和MV 转移，肿瘤的进展与肿瘤组织中MVD 和LVD 密切相关[9-10]。JANI 等[11]发现单次高剂量的射线可直接杀伤MV 的内皮细胞，同时使MV 渗漏，管腔塌陷，抑制肿瘤MV 的生成。本实验以单次10 Gy 的高剂量照射肿瘤后，MVD 明显减少，符合相关研究[12]。贝伐珠单抗是一种重组人源化免疫球蛋白G1（IGG1）单克隆抗体，通过与MV 内皮细胞表面的生长因子A（VEGF-A）结合，抑制其与VEGF 受体-2（VEGFR-2）结合，从而抑制MV 生成[13]。结合本研究表明，单次10 Gy 的近距离照射对MV 内皮细胞的直接损伤作用尚不如贝伐珠单抗对MV 内皮细胞的抑制作用。同时本实验结果表明贝伐珠单抗能抑制MV 的生成，但对LVD 的生成无明显抑制作用，单次10 Gy 的近距离照射却能抑制LV 的生成。联合治疗相对于单独使用SFBR和贝伐珠单抗能有效地抑制肿瘤LV 的生成。其机制除了射线直接导致LV 内皮细胞坏死、凋亡外，射线和贝伐珠单抗同时作用于肿瘤MV，在抑制肿瘤MV 生成的同时，高剂量的射线使残存的肿瘤MV 发生塌陷闭塞，阻断了血管内皮生长因子D（VEGF-D）等促LV 生成的细胞因子进入肿瘤组织内诱导LV生成[14]。

肿瘤VM 是近年来发现的肿瘤组织中特殊的管道，是由肿瘤干细胞围成的类似于血管的管腔结构，为肿瘤提供血液供应[15]。目前的抗血管生成药物对VM 无效。当MV 的生成受到抑制时，肿瘤组织内部呈乏氧环境，可促进VM 的形成，肿瘤细胞通过VM 继续获得营养并通过其向远处转移[16-17]。肿瘤组织中VMD 与肿瘤的预后呈负相关[18-19]。TURESSON 等[20]发现射线可直接破坏肿瘤干细胞DNA 双链，导致细胞死亡。同时残存的细胞内线粒体、内质网等亚单位肿胀坏死，失去增殖能力，呈亚致死状态，若细胞亚致死状态不能逆转，将发生程序性死亡即细胞凋亡。本研究表明，单次10 Gy 近距离照射可抑制LV 的生成，而当近距离照射与贝伐珠单抗联合时效果更明显。其机制可能是高剂量的射线使VM 的干细胞发生坏死，同时联合治疗有效地抑制了肿瘤MV 与LV 的生成，使亚致死损伤的干细胞因缺乏相应原料不能自我修复进而发生凋亡。

SUVmax是评价肿瘤代谢活性的重要指标。常用来评估肿瘤治疗效果和预测肿瘤的预后，其数值的大小与肿瘤代谢活性成正比，SUVmax升高常提示预后不良[21-22]。Ki-67 是一种增殖的细胞标志物，只表达于细胞周期的活跃阶段。Ki-67 的表达反映了肿瘤的增殖率。Ki-67 高表达提示预后不良[23-24]。本研究发现，联合治疗除直接损伤肿瘤细胞外，可同时抑制肿瘤MV、LV 和VM 的生成，使肿瘤细胞能量供应不足，抑制肿瘤的代谢活性，促进肿瘤细胞的凋亡，达到控制肿瘤生长的能力。

综上所述，SFBR 联合贝伐珠单抗可有效抑制结肠癌脉管系统的生成，降低肿瘤细胞的代谢活性，促进肿瘤细胞凋亡，从而达到抑制结肠癌生长的作用，具有较高的临床应用价值。但其抑制脉管系统生成的具体机制以及SFBR 与贝伐珠单抗最佳的结合方式和时机还有待于进一步的研究。