黄芪诱导人肺癌A549细胞凋亡及作用机制的初步研究

李成亮 王 同

2020年全球最新癌症负担数据显示肺癌是目前世界上发病率排行第二的恶性肿瘤，且是导致癌症死亡的主要原因(占癌症死亡总数的18%)[1]。肺癌病理分型包括非小细胞肺癌和小细胞肺癌。非小细胞肺癌在临床上最为多见。鉴于目前临床上肺癌放化疗治疗的耐药性增加，以及这些传统疗法的毒性，需要一种新的、无毒的抗癌治疗方法。最佳的治疗方法是能够区分不同类型的细胞，以减少副作用，而植物是一个有希望的来源。植物性或衍生性化合物通常对正常细胞无毒。所有现代医学的四分之一直接或间接来源于植物[2]。黄芪是一种在临床治疗中常用的中药，现代药理学表明具有提高免疫、脏器保护、抗肿瘤等疗效。既往研究表明黄芪能有效抑制肝癌[3]、胰腺癌[4]、胃癌[5]肿瘤细胞的生长，但少有文献报道黄芪对人肺癌A549细胞体外增殖和凋亡的影响。本文通过研究黄芪在体外对人A549细胞增殖和凋亡的作用，初步探讨其促进A549细胞凋亡可能的分子机制。

1 材料与方法

1.1 细胞株

人非小细胞肺癌A549细胞株由安徽医科大学第二附属医院科研实验中心馈赠

1.2 药物

黄芪注射液，规格10 ml/支(每1 ml相当于黄芪生药2 g)，购于神威药业集团。临用前原液使用培养基稀释到所需浓度。

1.3 试剂

RPMI-1640培养基、青霉素-链霉素溶液(100X)、胰蛋白酶、CCK-8试剂盒购于武汉普诺赛生命科技公司；胎牛血清购于美国Gbico公司；Annexin-V-FITC/PI试剂盒购于七海复泰生物科技公司；兔多抗survivin、兔多抗bax、兔多抗bcl-2购于美国Affinity公司；引物委托擎科生物科技公司合成。

1.4 方法

1.4.1 细胞培养及分组 细胞培养：将配置好的含10%胎牛血清、1%青-链霉素的RPMI-1640培养基放入37 ℃恒温水浴锅中预热。冻存的细胞从液氮中取出后，冻存管迅速置于37 ℃水浴锅中，完全解冻后，将细胞悬液吸到15 ml离心管中，离心管加入4 ml完全培养基重悬细胞，1000 rpm离心，吸取上清液，丢弃。加入完全培养基4 ml重悬细胞，然后将A549细胞株置于37°、5% CO2，相对湿度为90%的培养箱中无菌培养。当培养基变黄时进行换液，弃除旧培养液，3 ml PBS清洗细胞培养瓶两遍，然后加入完全培养基4 ml，重新放入细胞培养箱中继续培养。

分组：实验设空白对照组(不加药物,浓度为0 g/ml)和4组不同浓度的黄芪药物干预组：1组(0.1 g/ml)、2组(0.5 g/ml )、3组(1.0 g/ml)、4组(1.6 g/ml)。各组药物浓度均使用完全培养基进行稀释得到。

1.4.2 CCK-8法检测黄芪注射液对人非小细胞肺癌A549细胞增殖的影响 取对数生长期的A549细胞调成单细胞悬液5×104个/ml，以每孔100 μl接中到96孔板，加入了细胞的96孔板放入培养箱中继续培养12 h，待细胞贴壁。12 h后，实验组分别加入含有终浓度为0.1 g/ml、0.5 g/ml、1.0 g/ml、1.6 g/ml的药物100 μl，每孔总体积为200 μl。每种药物浓度设4个复孔，空白对照组只加完全培养基100 μl。以仅含有200 μl的完全培养基，不接种细胞的空白组作为调零孔。将空白对照组、实验组细胞置于96孔板中，于37 ℃、5% CO2培养箱中分别培养 24 h、48 h。然后，每孔加入10 μl CCK-8试剂，培养箱内继续培养4 h 。然后在酶标仪450 nm 波长处检测各孔的吸光度值(OD值)，各孔吸光度值调零后计算抑制率，抑制率(%)=(1-实验组OD值/空白对照组OD值)×100%。

1.4.3 Annexin-V-FITC/PI双染法检测黄芪注射液对人非小细胞肺癌A549细胞凋亡的影响 取生长状态良好的A549细胞，调整细胞密度为1×105个/ml,以每孔接种2 ml接种于6孔板，然后放入37 ℃、5% CO2的培养箱中继续培养。当6孔板中细胞大约铺满孔的70%左右时弃去孔内旧培养基，然后每孔加入浓度为0.1 g/ml、0.5 g/ml、1.0 g/ml和1.6 g/ml的药物各 2 ml，并设置空白对照组,只加 2 ml完全培养基，分别放入培养箱中继续培养24 h、48 h。到时间后收集细胞，按照凋亡试剂盒操作：加入Annexin V-FITC抗体5 μl，轻轻混匀，室温避光孵育15 min。加入PI抗体10 μl，轻轻混匀。冰浴避光放置5 min。在30 min内进行流式细胞仪检测。

1.4.4 RT-PCR检测黄芪注射液干预A549细胞后Survivin mRNA、Bcl-2 mRNA及Bax mRNA水平的变化 由Genbank获取凋亡相关基因(Survivin、Bcl-2、Bax)和内参(GAPDH)上下游序列，并委托擎科生物科技公司合成。实验分为5组，对照组为不加药组，去除孔内旧培养液后加入 2 ml PBS清洗2次，然后加入2 ml 完全培养基。其余4组为实验组：弃去孔内旧培养液后加入2 ml PBS清洗2次，再向每孔中加入2 ml浓度分别为0.1 g/ml、0.5 g/ml、1.0 g/ml、1.6 g/ml的药物，再放入培养箱中继续培养48 h。TRIzol法提取A549细胞总RNA并测定RNA浓度，逆转录获得cDNA后再进行PCR扩增反应，最后进行实时荧光定量PCR检测。根据公式△Ct=△Ct目的基因-△Ct内参基因，△△Ct=△Ct实验组-△Ct空白对照组进行计算，最终数据以2-△△Ct为结果进行分析。

1.4.5 采用Western Blot方法检测黄芪注射液干预A549细胞后凋亡相关蛋白Survivin、Bcl-2及Bax表达水平的变化 实验分组及药物处理同1.4.4，待培养48 h后加入裂解液冰上裂解30 min，4 ℃下12000 rpm离心5 min，BCA法测定蛋白浓度后取40 μg样品与上样缓冲液混合，煮沸10 min，进行SDS-PAGE电泳，转PVDF膜。将膜在含5%脱脂奶粉的TBST中室温下封闭2 h，随后加入一抗(兔多抗survivin、兔多抗bax、兔多抗bcl-2，1∶1000稀释)，4 ℃孵育过夜。第二天加入HRP标记羊抗兔二抗(1∶50000稀释)，ECL化学发光试剂检测。以GAPDH为内参，以条带灰度值测定Bcl-2、Bax、Survivin蛋白的相对表达量。

1.5 统计分析

2 结果

2.1 黄芪注射液对A549细胞体外增殖的影响

CCK-8法检测黄芪注射液不同浓度、不同时间段对A549细胞体外增殖的影响，结果显示：黄芪注射液干预后能明显抑制A549细胞的增长，且具有一定的浓度依赖性和时间依赖性。比较4个实验组和空白对照组的抑制率，差异均具有统计学意义(P<0.01)。单因素方差分析显示：在同一时间段，随着药物浓度的增加，药物对细胞的增殖抑制率增加，差异具有统计学意义(P<0.01)。在同一药物浓度下，黄芪对A549细胞的增殖抑制率48 h高于24 h,差异具有统计学意义(P<0.01)。结果见表1、图1。

表1 不同浓度的黄芪注射液干预A549细胞24h、48h后对增殖的影响

图1 不同浓度的黄芪注射液对A549细胞的抑制率

2.2 黄芪注射液对人非小细胞肺癌A549细胞凋亡的影响

流式细胞术结果显示，不同浓度的黄芪注射液干预24 h后细胞凋亡率分别为(8.42±0.32)% 、(13.83±0.42)%、(18.86±0.29)%、(23.12±0.23)%。干预48 h后凋亡率为(13.02±0.39)%、(18.34±0.68)%、(24.95±0.58)%、(32.88±0.90)%。空白对照组24 h凋亡率为(6.17±0.20)%、48 h凋亡率为(5.61±0.10)%。各实验组凋亡率高于对照组，且相同浓度的黄芪注射液48 h的凋亡率高于24 h。各实验组与空白对照组相比差异均有统计学意义(P<0.01)，不同浓度的黄芪干预组之间差异具有统计学意义 (P<0.01)。

2.3 黄芪注射液对A549细胞凋亡相关基因表达的影响

与空白对照组相比，经药物干预48 h后，随着药物浓度的增加，A549细胞Survivin mRNA、Bcl-2 mRNA表达降低(P<0.05)，Bax mRNA表达增加(P<0.01)，差异具有统计学意义。以GAPDH为内参，2-△△Ct为结果进行分析。结果见表2，图2。

表2 黄芪注射液对A549细胞凋亡相关基因表达的影响

2.4 黄芪注射液对A549细胞凋亡相关蛋白表达的影响

黄芪注射液作用A549细胞48 h后，通过western blot检测Bcl-2、Bax、Survivin蛋白的表达情况，以Survivin/GAPDH、Bcl-2/GAPDH 、Bax/GAPDH表示蛋白的相对表达含量，结果显示:随着药物浓度的升高，Survivin蛋白、Bcl-2蛋白表达量逐渐减少(P<0.05)，Bax蛋白表达量逐渐增加(P<0.01)。结果见表3，图3、4。

图2 RT-PCR检测Survivin mRNA、Bcl-2 mRNA和Bax mRNA表达结果

表3 黄芪注射液对A549细胞凋亡相关蛋白表达的影响

3 讨论

近年来肺癌的治疗出现了许多新策略，如分子靶向治疗、免疫治疗、中医药治疗。通过多种途径明显改善了患者的预后。但尽管如此，全身化疗仍是肺癌不可替代的基础治疗手段。长期暴露于特定的化疗药物后，肿瘤细胞对一系列具有不同结构和功能的药物产生交叉耐药性，这种现象被称为多药耐药性(MDR)。MDR由许多不同的机制共同作用后产生，凋亡逃逸是其中一个重要的机制。最近的证据有力地表明，癌细胞中的几种因子可以增强抗癌药物诱导的细胞凋亡的抵抗力。

Survivin包含一个杆状病毒凋亡抑制重复序列(BIR)蛋白结构域，该结构域将其归类为凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein,IAP)家族成员[6]。目前研究发现，Survivin对细胞凋亡的抑制分子机制如下[7]：Survivin通过直接抑制负责诱导和执行凋亡的caspase；Smac/DIABLO与细胞色素C一起从线粒体释放到胞浆中，Smac/DIABLO可以通过结合和抑制IAP蛋白的抑制效应来促进细胞凋亡；Survivin可能通过结合和隔离Smac/DIABLO间接抑制caspase活性，从而阻止Smac/DIABLO与其他IAP结合，从而抑制细胞死亡，促进癌细胞存活。近年来研究发现，在大多数人类肿瘤细胞中都可以检测到Survivin，包括结肠癌[8]、乳腺癌[9]、肺癌[10]等，但在正常成人组织却罕见其表达。目前仅在正常成人的结肠隐窝的底部[11]、胎盘组织[12]中有所发现。这些特点说明Survivin基因与细胞增殖之间有着密不可分的联系。余江涛等[13]发现survivin基因在甲状腺癌组织和细胞中呈高表达,沉默其表达可诱导甲状腺癌细胞凋亡。贾富鑫等[14]发现survivin基因在胰头癌组织的表达升高，且与胰头癌的发生发展及预后密切相关。

图3 Survivin蛋白、Bcl-2蛋白和Bax蛋白的相对表达情况

图4 不同浓度黄芪注射液作用A549细胞48 h后Survivin、Bcl-2、Bax蛋白质电泳图

Bcl-2基因发现于B细胞滤泡性淋巴瘤的t(14；18)染色体易位断裂点，Bcl-2家族蛋白也是调控细胞凋亡的关键因子。Bcl-2家族包括三类，第一类抑制凋亡(BCL-2,BCL-XL,BCL-W,MCL1,BCL-B)，而第二类促进凋亡( BAX,BAK and BOK )，第三类不同的BH3-Only蛋白具有一个保守的BH3结构域，它可以结合并调节抗凋亡的bcl-2蛋白，从而促进细胞凋亡[15]。Bcl-2家族主要参与线粒体凋亡途径，目前认为机制如下：在接收到不同的凋亡刺激后，两个重要的促凋亡蛋白Bax和Bak通过形成线粒体外膜通透性(MOMP)复合物来启动细胞凋亡[16]。MOMP的形成导致细胞色素C和其他因子从线粒体膜间间隙释放出来，进而激活关键的caspase级联。Bcl-2蛋白家族的抗凋亡和促凋亡蛋白之间的相互作用可以抑制或激活MOMP，并决定细胞的命运[17]。裴岩岩、张璐等[18-19]体外实验研究发现Bax mRNA和蛋白表达水平上调，Bcl-2 mRNA和蛋白表达水平下调，能抑制人乳腺癌MCF-7细胞、肾癌ACHN细胞增殖并诱导肿瘤细胞凋亡。

随着科学技术的进步，很多中草药作用机制的逐步被阐明。黄芪提取物中抗肿瘤的主要活性成分为黄芪甲苷。安小翠等[20]研究发现黄芪甲苷可以通过调节氧化应激和NF-κB信号通路实现抑制肝癌细胞HepG2的增殖并促进其凋亡。曹艳等[21]研究发现在体外黄芪甲苷能够通过抑制细胞外信号调节激酶(ERK)信号通路减少细胞MMP-2和MMP-9的表达而发挥抑制胃癌细胞侵袭的能力。本实验通过对细胞凋亡相关机制的研究，发现：黄芪注射液能有效抑制人非小细胞肺癌A549细胞的体外增殖。这可能与药物下调Survivin 、Bcl-2基因的转录和蛋白质表达，上调Bax基因的转录和蛋白质表达，从而促进细胞凋亡有关。希望随着分子生物学的发展，更多的中药提取物可以作为临床治疗过程中的辅助抗肿瘤药物，进而提高肿瘤细胞凋亡率，降低肿瘤细胞多药耐药，进一步改善患者预后。