创伤性颅脑损伤患者血清M-sec蛋白的表达与认知功能障碍的相关性研究

冯九庚，邹树峰,陈伟,2

（1.南昌大学第一附属医院神经外科，南昌 330006；2.上海市浦东新区人民医院神经外科，上海 201299）

创伤性颅脑损伤（Traumatic Brain Injury,TBI）的发病率逐年增长[1]，因神经元功能缺失所致的功能障碍改变严重影响着患者的生存质量[2]。近年来，纳米样隧道管（Tunneling Nanotubes,TnTs）已经成为细胞间研究的热点之一。尽管目前对于TnTs的形成尚不完全明确，有研究显示哺乳动物的肿瘤坏死因子-α诱导因子2（Tumor Necrosis Factor-alpha Induced Protein2,TNFAIP2，又名Msec）蛋白为TnTs形成过程中不可或缺的蛋白[3-4]，并受肿瘤坏死因子-α(Tumor Necrosis Factoralpha,TNF-α)调节，因此我们推测M-sec蛋白可以作为TnTs形成的标记蛋白。本文对TBI患者进行回顾性研究，收集TBI患者268例，动态检测伤后血清TNF-α、M-sec蛋白含量的变化，伤后6个月采用蒙特利尔认知评估量表（Montreal cognitive assessment,MoCA）评价患者有无认知功能障碍，并比较多时间节点血清M-sec蛋白含量与MoCA评分的相关性。

1 研究对象

1.1研究组选入标准 明确的TBI病史，TBI后24小时内入院；年龄16~65岁；均受过小学以上程度教育；病情稳定，在急性期内可耐受腰穿，后期可进行认知功能的测定。排除标准：既往有严重的TBI病史及其它颅内疾病史；受伤前有反复脑卒中及痴呆表现；合并其它严重的多脏器损伤；既往有垂体和甲状腺疾病、严重肝衰竭、糖尿病、恶性肿瘤等全身性疾病史；严重失语和意识障碍；死亡及失访病例。共纳入研究268例，男性181例，女性87例；年龄18~65岁，平均年龄（41.82±11.22）岁；初中文化程度78例，高中文化程度103例，大学及以上文化程度87例；受伤方式：车祸伤141例，打击伤23例，坠落伤88例，跌伤12例；格拉斯哥昏迷评分（Glasgow Coma Score,GCS）3~8分27例，9~12分51例，13~15分190例。同时分别在三个医院共选取100例常规体检成年患者作为对照，且MoCA评分在正常范围内，其中男性70例，女性30例，年龄在18~65岁，平均年龄（40.38±10.66）岁；初中文化程度28例，高中文化程度38例，大学及以上文化程度34例。本研究经过病人或其家属的知情同意并自愿参加，上海市浦东新区人民医院、南京医科大学第一附属医院及南昌大学第一附属医院伦理委员会审查同意。两组年龄、性别和文化程度比较无明显差异（P>0.05）,具有可比性。

1.2认知功能的评估 本组患者在TBI后6个月由经过正规培训的神经外科及创伤中心医师对其进行认知功能的测试。测试时间为北京时间下午14:00，最长时限为30分钟。选用MoCA量表来评估患者认知功能，总分为30分，得分>26分提示存在认知功能障碍。比较认知功能障碍与无认知功能障碍患者的差异。

1.3 TNF-a、M-sec测定方法 研究组于伤后第1、3、5、7、14天清晨采集空腹血4 mL，4000 r/min×10 min，取上清液，-20℃保存待用。采用化学发光法分别测定血清TNF-α和M-sec含量，采用酶联免疫吸附法（ELISA），严格按照各自试剂盒（博士德生物，中国）的操作说明进行操作，酶标仪（TECAN，奥地利）在450 nm波长下测度吸光度值，通过标准曲线计算血清TNF-α、M-sec蛋白浓度，对照组早晨空腹采集静脉血4 mL，同上方法保存和测定，分析血清TNF-α、M-sec蛋白动态变化与认知功能障碍的相关性。

1.4统计学分析 应用SPSS 20.0统计软件，进行分析计量资料用(±s)表示，组间比较有采用设计两样本均数t检验，对有认知功能障碍患者与无认知功能障碍患者比较采用Mann-Whitney U检验。TBI后个时间点血清M-sec蛋白与MoCA意义评分采用Pearson相关性分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TBI后认知功能障碍情况 根据MoCA量表评估，研究组伤后6个月存在认知功能障碍108例，（40.29%），认知功能障碍病人在视空间与执行、注意力与计算、语言能力、抽象能力及延迟记忆等方面差异明显（P<0.05）,而在命名和定向力方面无显著差异(P>0.05)，见表1。

2.2 TBI后血清TNF-α、M-sec蛋白动态变化TNF-α和M-sec蛋白在正常对照组组含量分别为(0.56±0.11)ng/mL和(54.25±8.66)ng/mL。TBI患者血清TNF-α和M-sec蛋白含量在TBI后随着患者有无认知功能障碍而表达呈不同趋势，在无认知功能障碍患者中，TBI后第1天TNF-α、M-sec表达明显较对照组升高（P<0.05），且在伤后7 d内都维持在较高水平（P<0.05），在伤后14 d降低至与正常对照组无明显差异。而在TBI后有认知功能障碍组表现则不同，TNF-α、M-sec表达在伤后第1天则明显降低，与正常组及无认知功能障碍组差异明显（P<0.05），并在伤后第3天TNF-α、M-sec蛋白含量均降至最低水平，并与无认知功能障碍组差异明显（P<0.05），TBI后第5、7天两者的表达明显回升，甚至明显高于正常组（P<0.05），并与无认知功能障碍组无明显差异（P>0.05），在伤后14天，有认知功能障碍组的两者蛋白水平恢复到与无认知功能障碍组、正常对照组均无明显差异（P>0.05），见表2，3。

2.3 TBI患者血清M-sec动态变化与认知功能障碍的相关性分析 将患者伤后6个月的MoCA评分与各时间点血清M-sec含量进行Pearson相关性分析发现，伤后第3天血清M-sec表达与MoCA评分相关性最为明显（P<0.05），而伤后第5天Msec含量与MoCA评分则无明显的相关性（P>0.05）。说明TBI患者急性期血清M-sec含量有助于预测患者伤后有无认知功能障碍的发生，而且在伤后第3天的血清M-sec值与认知功能相关系数最大，说明伤后第3天血清M-sec蛋白含量最能反应认知功能的预后，见表4。

表1 有无认知功能障碍TBI患者Mo CA量表各认知领域评分比较

3 讨论

TBI后的神经元的治疗是一个世界范围内的难点、热点。星形胶质细胞（Astrocyte）是中枢神经系统中数量最多的细胞类型，除了支持、营养神经元外，还参与调控神经元的功能[5]。我们近期的研究结果显示，星形胶质细胞可能通过缓解神经元的钙超载从而产生保护作用[6]，但此过程的具体机制并不完全明确。我们前期针对于在星形胶质细胞中高表达的缝隙连接蛋白阿尔法1（GJA1）蛋白进行了深入的研究，并已证明非磷酸化的GJA1蛋白在星形胶质细胞对神经元的保护中起着极为重要的作用[7-8]，由于神经元的数量远远少于星形胶质细胞，单纯的相邻星形胶质细胞—神经元间GJA1的数量及功能不足以维持星形胶质细胞对神经元的保护作用。因此，我们推测其它的细胞间直接连接方式在脑损伤后星形胶质细胞对神经元的保护中可能起着更为重要的作用。目前，在这方面与TBI的相关的研究较少。

15年前，细胞间的TnTs通道被首次提及,其直径多在50~1000 nm,而长度一般在数微米到数百微米，可供较大分子量的物质通过（>1.2kD）[9-10]。M-sec最初被称为TNF-α诱导因子2，其功能尚不完全明确[11]。有研究显示，M-sec可诱导细胞膜的F-肌动蛋白（F-actin）形成凸起，进而延展形成TNTs通道[12]，因此M-sec蛋白亦被称为TnTs的标志蛋白[13]。当前与TNTs有关损伤后保护的研究也日渐增多，但目前多集中在与干细胞有关的损伤后修复方面[14-15]，且目前国内外在此领域的研究目前仅局限在体外实验中，尚未涉及到体内及临床领域。因此我们推测，星形胶质细胞在TBI后与通过TnTs对神经元起着更为广泛的保护作用。基于该设想，我们通过本实验发现，TBI后有认知功能障碍的患者在TBI后第1天血清TNF-α、M-sec蛋白表达明显低于正常对照组，而在伤后3天降至最低，尽管其在伤后第5天明显回升至与无认知功能障碍组无明显差异，但仍无法逆转神经元及其功能的损伤所致的认知功能障碍。而有趣的是，在TBI后无认知功能障碍患者血清TNF-a、Msec蛋白的表达则出现应激性升高，并且在7天内维持在一个相对较高的水平。针对于此现象分析，我们认为原因为（1）神经元及神经功能的损伤呈现不可逆性，尤其在急性期内，如缺乏神经元保护，则神经元及神经功能损伤则进一步明显、（2）无认知功能障碍患者在TBI后，颅内TNF-α等炎性代谢产物增多，TNF-α诱导M-sec表达升高，以诱导星形胶质细胞建立更多的与神经元的TnTs通道,以保护神经元功能。同时大量产生的M-sec蛋白则通过受损的脑血屏障进入血液，导致血清中M-sec表达增高、（3）在有认知功能障碍的患者中，TNF-α表达升高延迟，导致在急性期内诱导的M-sec蛋白表达降低，星形胶质细胞对神经元保护性的TnTs构建减少，损伤保护性效应减弱，神经元及神经功能损伤相对明显。

本研究中将患者TBI后6个月的MoCA量表评分与各时间点的M-sec蛋白含量进行Pearson相关性分析发现，在TBI后1、3天（急性期）M-sec蛋白含量与MoCA评分正相关，而在亚急性期内，M-sec蛋白含量则与MoCA评分无明显相关性。这说明TBI急性期的血清M-sec蛋白含量的检测可能有助于预测TBI患者伤后有无认知功能障碍发生，伤后第3天血清M-sec与MoCA相关系数R值最大，说明伤后第3天血清M-sec与认知功能的预后相关性最大。

表2 TBI患者血清TNF-α含量的变化（ng/mL）

表3 TBI患者血清M-s e c含量的变化（ng/mL）

表4 TBI患者血清M-s e c含量与Mo CA评分的Pe a rs on相关性分析

综上所述，TBI患者在急性期内的M-sec蛋白含量的降低与认知功能障碍的发生的相关性较大。对急性期内的M-sec蛋白含量进行动态监测，可能有助于了解星形胶质细胞对神经元的直接保护及随后的神经功能的保护的作用、早期预测TBI后神经元、神经功能损伤及评估认知功能障碍的程度及预后。不足之处在于，本研究病例数仍偏小，今后需进一步扩大临床样本，为TBI后神经元、神经功能的保护及认知功能障碍的预防、治疗提供潜在的靶点。