基于16S rRNA测序技术分析HLAP患者肠道微生态变化及与IL-1、TNF-α的关联性

黄奕森，曾以琳，张长青，陈雅妮，王育斌

（福建医科大学附属泉州第一医院消化内科，泉州 362000）

高脂血症性急性胰腺炎(Hyperlipidemic Acute Pancreatitis，HLAP)是由高三酰甘油血症而诱发的急性胰腺炎，患者临床上可出现胰腺局部炎性反应，更严重者甚至出现全身炎性反应综合征及器官功能衰竭。伴随着我国生活方式以及饮食习惯的变化，高三酰甘油血症已经成为了急性胰腺炎的主要发病因素，同时其发病率也正逐年升高，但目前对于其发病机制并不清楚，且主要治疗手段也不理想[2]。有文献记载，当肠道出现细菌易位，脂多糖等一系列毒素入侵体内时，免疫细胞识别后会分泌大量的炎性因子，促进机体进入低炎性状态，所以对于患者机体炎性反映的检测也是较为重要的[3]。肠道菌群变化是肠道微环境以及肠道结构功能的重要影响成分，有研究发现，急性胰腺炎患者需要较长时间的禁食，这会导致肠道菌群失衡以及肠道屏障功能受到破坏[4]。但目前对于肠道微生态变化是否促进HLAP的发生与发展还有待考究[5]。因此本研究选取我院收治的60例急性胰腺炎患者以及同期61例健康体检者临床资料进行分析，研究基于16S rRNA测序技术分析HLAP患者肠道微生态变化及与IL-1、TNF-α的关联性。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2020年6月至2020年12月泉州市第一医院收治的60例急性胰腺炎患者以及同期61例健康体检者作为研究对象，将其中高脂血症性急性胰腺炎列入HLAP组（n=33），非高脂血症性急性胰腺炎列入非HLAP组（n=27），健康体检者作为对照组（n=61）。HALP组33例，男性16例，女性17例，年龄38~61岁，平均年龄（53.23±5.98）岁，BMI指数19~23 kg/m2，平均BMI指数（22.41±1.01）kg/m2；非HALP组患者27例，男性14例，女性13例，年龄37~61岁，平均年龄（53.08±5.46）岁，BMI指数19~23 kg/m2，平均BMI指数（22.31±1.12）kg/m2，对照组61例，男性31例，女性30例，年龄37~61岁，平均年龄（53.11±5.61）岁，BMI指数19~23 kg/m2，平均BMI指数（22.24±1.07）kg/m2，两组患者一般资料差异比较无统计学意义，具有可比性（P＞0.05）（见表1）。纳入标准：患者符合《急性胰腺炎的诊断和治疗》[6]中急性胰腺炎诊断标准；HALP组患者伴有静脉乳糜血且TG 5.65～11.3 mmol/L或血清三酰甘油 （TG）>11.3 mmol/L；患者未合并其他系统性疾病，如高血压、糖尿病、心脏病、肾病、肝病等；患者精神意志正常可配合治疗。排除标准：患者合并恶性肿瘤、白血病等重大疾病；患者半年内曾使用免疫抑制剂；患者胃肠功能障碍，入院2天内肠功能未恢复者；入选者资料不完整；怀孕和哺乳期女性。

1.2方法 肠道检查微生态检查方法:病例组患者均在入院第一时间提取粪便并进行检测，对照组时间一致。收集粪便2 g，将其分装于无菌干燥小瓶内，同时标记后放于-80℃冰箱内保存。采用16S rRNA测序技术分析HLAP患者肠道菌群，将标本给予深圳华大基因股份有限公司进行数据分析和对比。粪便内DNA提取以及16S rDNA扩增方法：粪便细菌的总DNA严格按照购自翌圣生物上海科技有限公司的MolPureStool DNA Kit粪便DNA提取试剂盒进行检测；样本使用前以及高通量测序方法：将扩增子片段回收，同时采用T4 DNA聚合酶、Klenow DNA聚合酶以T4多核苷酸激酶把黏性末端恢复为平末端，随后将碱基A加于3端，促进DNA片段与3端具有T碱基的特殊接头相连，设计合成具有测序接头的双探针融合引物，将基因组DNA设置为模板，随后开始融合引物PCR，运用磁珠筛选目的扩增子片段，随后采用合适的文库开始制备簇以及测序。16S rDNA V4可变区引物序列：正向引物为5'-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3',反向引物3'-GGACTACHV GGGTWTCT-AAT-5'。在98℃下反应2 min，在95℃下反应20 s，在50℃下反应30 s，在72℃下反应30 s，以此顺序反复进行30次，再次在72℃下反应30 s，使用Ampure XP beads排除掉非目产物。平均分子长度以上海安捷伦科技有限公司的2100生物分析工具进行测量。数据分析：采取条码序列以内部所制作的程序将样品拆分。条码序列和测序的比对不允许有错误配对。在Hiseq2500，测序长度为P250，模式为PE250+8+8+250的平台开始双末端测序，下机数据将低质量序列去除，剩下的高质量数据运用在后期的分析中；将序列间相重叠的序列拼接为标签；在所获得相似度下将标签换做为运算分类单位，随后采用运算分类单位和数据库进行比对，对运算分类单位进行物种注释；在运算分类单位的基础上与物种注释结构进行样品物种复杂度的对比分析以及组间物种差异分析。样本组间差异分析：采用统计学方法对两组样本间的微生物丰度差异性进行测量，同时使用错误发现率对差异性显著性进行评估。在门纲目科属种之间差异性进行评价。采用Metastats软件对组间差异性进行分析。

血清学检测方法：血清学抽取时间与粪便样品收集时间一致。抽取患者空腹静脉血5 mL，并取2 mL放置于未加入抗凝剂的试管内，在常温下静置1 h，随后以转速为3500转/min，持续离心5 min，分离血清并冷藏于-80℃的冰箱内，送至检验科。IL-1选取上海双赢生物科技有限公司的IL-1 ELISA定量检测试剂盒并采用酶联免疫吸附定量检测法进行检测；TNF-α选取上海康朗生物技术有限公司的TNF-α检测试剂盒并采用双抗体夹心酶联免疫吸附法定量检测。

1.3观察指标 对比三组入选者肠道微生态以及血清IL-1、TNF-α水平；对比HALP组和非HLAP组患者肠道微生态。患者微生态以chao指数和shannon指数进行表达，chao指数：样本内群落的丰度，也就是样本中物种的数量，但并不指群落内每个物种丰度。shannon指数：指的是群落内多样性，群落内物种的丰富度和均匀度能够对其造成影响。

1.4方法 SPSS 20.0进行统计分析。年龄计量资料以(±s)的形式表示，组间采用独立样本t检验、组内均采用配对样本t检验；计数资料以[n（%）]表示，组间比较采用χ2检验，记P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1三组入选者粪便微生态对比 与对照组相比，HLAP组和非HLAP组运算分类单位、chao指数和shannon指数显著更低；与非HLAP组相比，HLAP组运算分类单位、chao指数和shannon指数显著更低，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

2.2三组入选者IL-1和TNF-α水平对比 与对照组相比，HLAP组和非HLAP组IL-1和TNF-α水平显著更高；与非HLAP组相比，HLAP组IL-1和TNF-α水平显著更高，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表1 三组入选者粪便微生态对比(±s)

表1 三组入选者粪便微生态对比(±s)

注：与对照组相比a P＜0.05；与非HLAP组相比b P＜0.05。

组别 运算分类单位 chao指数 shannon指数HLAP组（n=33）非HLAP组（n=27）对照组（n=61）2.51±0.18ab 2.78±0.26a 3.19±0.22 90.58＜0.001 FP 182.23±5.65ab 210.19±5.45a 224.23±5.89 575.29＜0.001 187.53±5.11ab 201.23±5.31a 218.77±5.12 409.01＜0.001

表2 三组入选者IL-1和TNF-α水平对比(±s)

表2 三组入选者IL-1和TNF-α水平对比(±s)

注：与对照组相比a P＜0.05；与非HLAP组相比b P＜0.05。

组别 IL-1（pg/L） TNF-α（pg/L）HLAP组（n=33）非HLAP组（n=27）对照组（n=61）108.21±10.08ab 64.52±10.31a 15.09±10.49 895.80＜0.001 FP 69.43±3.65ab 60.23±3.42a 40.51±3.39 823.98＜0.001

2.3 HLAP组和非HLAP组粪便菌群门丰度水平对比 相比于非HLAP组患者，HLAP组患者厚壁菌门、拟杆菌门显著更低，变形菌门、梭杆菌门以及放线菌门显著更高，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

2.4 HLAP组和非HLAP组粪便菌群属丰度水平对比 相比于非HLAP组患者，HLAP组患者双歧杆菌属、链球菌属、萨特菌属和艾克曼菌属显著更高，拟杆菌属、瘤胃球菌、梭菌属、戴阿利斯特菌属以及巨球菌属显著更低，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表4。

表3 HLAP组和非HLAP组粪便菌群门丰度水平对比(±s)

表3 HLAP组和非HLAP组粪便菌群门丰度水平对比(±s)

组别 厚壁菌门 变形菌门 拟杆菌门 梭杆菌门 放线菌门HLAP组（n=33）非HLAP组（n=27）t P 41.56±5.43 48.08±3.42 5.417＜0.001 19.52±3.28 10.23±3.41 7.724＜0.001 21.56±3.51 40.12±3.38 20.717＜0.001 2.89±0.57 0.57±0.49 16.691＜0.001 3.56±0.43 1.23±0.59 17.675＜0.001

3 讨论

随着我国生活水平的提升以及不良饮食习惯的变法，我国高三酰甘油血症的发病率日益增加[7]。HALP又被称为高三酰甘油血症性胰腺炎，高三酰甘油血症是急性胰腺炎的常见致病因素[8-9]。有研究统计，HALP占到急性胰腺炎的40%左右，且发病率有升高的趋势[10]。肠道微生态是人类微生态中最大的组成部分，研究发现肠道微生态在急性胰腺炎的发生和发展中发挥着关键作用[11-12]。但目前对于HALP患者肠道微生态学研究较少，因此本次研究对其展开研究并检测患者血清炎性指标进行分析，为临床的诊治提供参考。

16S rRNA（16S核糖体RNA）测序技术是细菌编码rRNA所对应的DNA序列，在所有的细菌基因组内均存在，具有准确、快速和灵敏的特点，可全方位表达肠道菌群的种类、分布以及丰度[13]。本次研究则采用分析HLAP患者和同期健康体检者患者肠道菌群显示，与对照组相比，HLAP组和非HLAP组运算分类单位、chao指数和shannon指数显著更低；与非HLAP组相比，HLAP组运算分类单位、chao指数和shannon指数显著更低。这说明，HLAP在患者发病中存在较为明显的肠道微生态异常。研究过程中发现，急性胰腺炎发生时机体受刺激而释放出多种细胞因子和炎性介质，而IL-1作为一种细胞因子，是活化单核巨噬细胞所生成，可促进淋巴细胞抗体的大量生成，具有调节炎性反应的作用，在HLAP的进展中发挥着重要作用[14]。而TNF-α在HLAP的发生过程中具有始动作用，其作为一种促炎性细胞因子，是炎性反应的敏感指标，诱导IL-1等基因表达,导致炎症介质失控性释放,并促进和调节细胞因子、黏附分子以及一氧化氮等炎症介质分泌，且与疾病严重程度呈正相关[15]。在脂肪酶的促进下，三酰甘油会被分解为游离脂肪酸，而游离脂肪酸对于胰腺腺泡细胞以及毛细血管内皮细胞造成影响[16-17]。本研究发现，与对照组相比，HLAP组和非HLAP组IL-1和TNFα水平显著更高；与非HLAP组相比，HLAP组IL-1和TNF-α水平显著更高。笔者推测由于IL-1和TNF-α的生物膜细胞毒作用可对生物膜直接造成损伤，进而引发细胞和细胞器的肿胀异变，通透性也会随之升高，且其作为能够介导机体感染、创伤和炎症反应的重要细胞因子，参与了机体免疫系统的调节和炎症反应的发生发展过程，因此其水平越高表明患者病情越严重[18-19]。厚壁菌门、变形菌门、拟杆菌门、梭杆菌门以及放线菌门都是消化道内较为多见的细菌。本次研究发现，相比于非HLAP组患者，HLAP组患者厚壁菌门、拟杆菌门显著更低，变形菌门、梭杆菌门以及放线菌门显著更高。这表明，HLAP组患者比非HLAP组急性胰腺炎患者肠道失衡更为明显。在菌属中，拟杆菌变化并不大，而其他菌属均出现明显的变化。其中对人体有害的拟杆菌属、瘤胃球菌、梭菌属、戴阿利斯特菌属以及巨球菌属出现明显的降低，而双歧杆菌属、链球菌属、萨特菌属和艾克曼菌属明显增加，这可能是因为机体对于菌群失衡以及肠道菌群移位的阻止形式[20-21]。本次研究通过对比性研究发现，HLAP患者肠道微生态以及炎性反应均出现明显的失衡，存在相关性。但本次研究可能因为病例收集的因素，导致实验存在一定偏差，以后因弥补此不足。

综上所述，肠道微生态的失衡与HLAP患者存在明显的相关性，在其发展过程中扮演着重要的角色，同时患者伴随着炎性因子的升高。日后，我们需加强对高三酰甘油患者的管理，以预防和减少急性胰腺炎尤其是重症急性胰腺炎的发生。

表4 HLAP组和非HLAP组粪便菌群属丰度水平对比(±s)

表4 HLAP组和非HLAP组粪便菌群属丰度水平对比(±s)

组别 拟杆菌属 双歧杆菌属 瘤胃球菌属 梭菌属 链球菌属HLAP组（n=33）非HLAP组（n=27）t P 19.43±5.08 22.14±5.12 2.041 0.045 2.45±0.51 0.43±0.28 21.945＜0.001 2.53±0.42 3.61±0.38 10.338＜0.001 5.41±1.42 11.87±1.54 16.877＜0.001 5.65±0.42 0.32±0.24 58.530＜0.001

续表4 HLAP组和非HLAP组治疗后粪便菌群属丰度水平对比(±s)

续表4 HLAP组和非HLAP组治疗后粪便菌群属丰度水平对比(±s)

组别 萨特菌属 艾克曼菌属 戴阿利斯特菌属 巨单胞菌属 巨球菌属HLAP组（n=33）非HLAP组（n=27）t P 3.89±0.43 1.24±0.46 23.015＜0.001 3.75±0.48 1.15±0.42 22.064＜0.001 0.88±0.43 2.78±0.31 19.221＜0.001 3.65±1.54 8.79±1.68 12.344＜0.001 0.54±0.28 3.89±0.41 37.484＜0.001