基于网络药理学探讨黄芪桂枝五物汤治疗颈椎病的作用机制❋

马增斌，邸学士，袁巧妹，孙悦礼，龙水文，冉 宇，覃昌龙，张 超，李忠泽，郑志坚，陈 江,7△，王拥军4,△

(1.北京医院，北京 100730；2.国家老年医学中心，北京 100730；3.中国医学科学院老年医学研究院，北京 100730；4.上海中医药大学，上海 201203；5.北京中医药大学，北京 100029；6.上海中医药大学脊柱病研究所，上海 200032；7.北京中医药大学东直门医院，北京 100700)

颈椎病是指由多种原因引起的以颈椎间盘退变为主，累及周围结构、组织发生病理改变的一种临床综合征[1]。近年来，颈椎病的发病逐渐年轻化，严重威胁着人们的生活健康[2]。颈椎病临床治疗主要包括手术和非手术治疗两种方式,非手术治疗包括西药、中药、康复手法、外治等方式。西药治疗以缓解症状为主，具有一定不良反应及副作用，中药治疗从病因入手，其副作用小且具有明显优势[3]。

颈椎病属于中医“项痹”“血痹”“项强”“颈肩痛”等范畴，国家中医药管理局将其分为风寒湿痹、气血亏虚、气滞血瘀、痰湿阻滞、肝肾不足5型[3]。中医认为肝主筋，脾主肉，肾主骨，该病的发生发展与肝脾肾三脏关系密切，经络痹阻、气虚血瘀为其基本病机[4]。黄芪桂枝五物汤出自《金匮要略》，由黄芪、桂枝、白芍、生姜、大枣5味中药组成，黄芪为君甘温益气，配合桂枝散风寒而益气和血通经，配伍白芍合营通痹，佐使姜枣合营卫、调诸药，5味中药相配伍益气活血、活络通痹。大量临床研究证实，黄芪桂枝五物汤治疗各类型颈椎病均具有一定疗效[5-7]。本研究采用网络药理学方法，从整体角度探讨黄芪桂枝五物汤治疗颈椎病的药效物质基础和作用机制，为后续深入研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 中药化合物获取及活性成分筛选

以“黄芪”“桂枝”“白芍”“生姜”“大枣”为检索词，在TCMSP平台[8]进行检索，将参数生物利用度设置大于或等于30%，类药性设置大于或等于0.18，筛选5味中药的活性成分。

1.2 活性成分靶点预测

通过TCMSP平台获取各中药成分相关靶点蛋白，并对蛋白名称标准化。

1.3 颈椎病靶点获取

将“cervical myelopathy”“cervical spondylosis”“cervical spondylotic radiculopathy”作为检索词，分别在疾病靶点数据库筛选相关靶点。通过ImageGP平台绘制成分靶点、疾病靶点韦恩图。

1.4 中药-活性成分-靶点网络构建

采用Cytoscape 3.7.1软件构建网络图，每个节点所具有的关系数量记为度值，度值越高其代表节点所关联的节点越多，该节点重要性就越高。

1.5 蛋白质互相作用关系网络构建

利用STRING数据库获取交集靶点互相作用关系(protein-protein interaction，PPI)，通过cytoscape绘制蛋白相互作用关系网络图。

1.6 GO功能及通路富集分析

通过DAVID6.8数据库进行GO及通路富集(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)分析，通过微生信平台绘图。

2 结果

2.1 中药活性成分筛选结果

经TCMSP数据库筛选，剔除无对应靶标及与疾病靶点无交集靶标的化合物后，共获得活性成分41种，其中包括quercetin、beta-sitosterol、kaempferol等化合物(详见表1)。

表1 黄芪桂枝五物汤中药活性成分比较

2.2 靶点预测

通过GeneCards数据库、OMIM数据库、DisGeNET数据库获取颈椎病相关靶点12358个，通过TCMSP数据库获取黄芪桂枝五物汤中药靶点227个。通过ImageGP平台对2组靶点取交集，获得187个黄芪桂枝五物汤治疗颈椎病的潜在作用靶点(见图1)。

图1 “黄芪桂枝五物汤靶标基因-颈椎病相关基因”韦恩图

2.3 中药-活性成分-交集靶点网络构建及分析

构建“中药-活性成分-交集靶点-疾病“网络图，(见图2)，该网络由235个节点879条边组成，其中节点代表中药及其活性成分和靶点，边代表中药与活性成分、活性成分与靶点的相互关系(如图2)。

注：其中绿色节点代表黄芪桂枝五物汤中药，紫色、灰色、红色、青色节点代表中药活性成分，蓝色节点代表交集靶点

2.4 PPI分析

经STRING数据库获取黄芪桂枝五物汤治疗颈椎病潜在作用靶点的互相作用关系，通过Cytoscape 3.7.1绘制靶点蛋白互相作用关系网络图(如图3)，节点表示靶点蛋白，边表示2个蛋白相连，网络中共计167个靶点蛋白1292条边，度值越高节点越大，在网络中所占有的地位越大，其中度值排名的靶点包括AKT1、TP53、JUN、TNF、IL6、CTNNB1、EGFR、CASP3、RELA、VEGFA，推测其在黄芪桂枝五物汤治疗颈椎病过程中具有重要地位。

图3 黄芪桂枝五物汤中药与颈椎病交集靶点蛋白质互相作用关系网络图

2.5 GO富集分析及KEGG通路分析

对黄芪桂枝五物汤治疗颈椎病潜在作用靶点进行GO、KEGG分析。通过bioinformatics平台对分析结果进行可视化展示(见图4)。GO分析结果示，BP相关条目699条，生物过程主要涉及RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控、DNA复制、药物反应、信号传导、凋亡的负调控等生物过程。MF相关条目134条，分子功能主要包括参与蛋白质、酶、转录因子、DNA、ATP等生命物质的结合作用，并影响蛋白质异二聚体、转录因子活性；CC相关条目46条，靶基因主要与细胞核、细胞质、质膜、线粒体等部位关系密切。

图4 黄芪桂枝五物汤中药与颈椎病交集靶点GO富集分析柱状图

KEGG富集分析结果显示，共获取黄芪桂枝五物汤治疗颈椎病潜在作用靶点相关通路130个(图5)。

图5 黄芪桂枝五物汤中药与颈椎病交集靶点KEGG通路富集分析气泡图

3 讨论

颈椎病是一种病程漫长、症状复杂，以颈肩僵硬、疼痛、麻木较为常见，伴或不伴有头痛、头晕，严重者可出现四肢无力、走路不稳等特点的临床综合症。颈椎病病理机制复杂，多由颈椎间盘退行性改变、椎体骨质增生、韧带肥厚钙化等诱因导致，并与年龄、生活方式等因素关系密切[9]。张仲景首次提出“血痹阴阳俱微……黄芪桂枝五物汤主之”。中医认为颈椎病患者病程漫长，久病则气血失和，经络失于濡养，不荣则麻；瘀血、顽痰有形之邪共同阻滞经脉，不通则痛[10]。黄芪桂枝五物汤具有益气活血、活络通痹之功。现代药理学研究证实，黄芪桂枝五物汤能够调节免疫，降低氧化反应，促进神经修复[11-13]。

本研究共筛选出黄芪桂枝五物汤治疗颈椎病的41种活性成分，其中槲皮素是一种天然黄酮类化合物。有研究表明，槲皮素能够减少髓核细胞凋亡，防止髓核细胞外基质变性[14]，还可以通过SIRT1-自噬途径减轻椎间盘退变[15]。此外槲皮素可抑制髓核细胞中衰老相关因子的表达，从而减缓椎间盘退变的进展[16]；山柰酚同属黄酮类化合物，可通过降低细胞凋亡、增强细胞活力、增加抗炎细胞因子水平来减缓椎间盘退变[17]；β-谷甾醇和异鼠李素2种化合物均具有抗炎、抗氧化作用[18-20]，炎性反应及过氧化均为椎间盘退变的诱因[21]，笔者推测β-谷甾醇和异鼠李素可能通过上述途径减缓椎间盘退变。通过PPI靶点网络拓扑分析，对靶点按照度值排序，排名越靠前的靶点在黄芪桂枝五物汤治疗颈椎病过程中越重要，其中排名靠前的靶点包括AKT1、细胞肿瘤抗原p53(Cellular tumor antigen p53，TP53)、转录因子AP-1(transcription factor AP-1，JUN)、TNF、白细胞介素(Interleukin，IL)-6、EGFR、CASP3、血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factor A，VEGFA)。AKT1属于苏氨酸蛋白激酶，能够调控细胞的增殖和生长。王云浩等[22]认为该蛋白与髓核细胞外基质降解有关，进而影响椎间盘退变；TNF是一种常见的蛋白家族，国外细胞实验证实TNF参与髓核细胞钙化，从而影响椎间盘退变[23]，其家族成员TNF-α被证实能够参与炎症反应[24]，并可影响生长因子的表达[25]，进而促使椎间盘退变。此外，TGF-α和EGFR均可促进血管组织向髓核内生长，加重椎间盘退变[26]。

通过GO富集分析结果推测，黄芪桂枝五物汤有效成分可能作用于靶点蛋白的细胞核、细胞质、质膜、线粒体等部位，并通过RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控、DNA复制、药物反应、信号传导、凋亡的负调控等生物过程，参与蛋白质、酶、转录因子、DNA等生命物质的结合作用，并影响蛋白质异二聚体、转录因子活性。KEGG通路富集分析中，PI3K-Akt、MAPK、NF-κB、缺氧诱导因子(hypoxia-inducible factor，HIF)-1、叉头框蛋白(forkhead box，FOX)O等信号通路富集靶点较多。PI3K-Akt作为一个经典的信号通路，国内学者刘福水等[27]发现，PI3K-Akt通路能介导颈后伸肌细胞的自噬、凋亡平衡；童秀冰等[28]在1项动物试验中也发现，PI3K-Akt通路相关蛋白的表达可能影响颈椎间盘软骨细胞的凋亡水平；此外，该通路已被证实能够诱导退变髓核细胞的血管长入，抑制随髓核细胞凋亡[29]，促进髓核细胞聚集蛋白聚糖及Ⅱ型胶原的表达[30]。MAPK通路是细胞信息传递的重要通路。国外研究证实，MAPK通路能够抑制大鼠退行性颈椎间盘模型炎症反应和基质变性[31]。国内学者董良杰等[32]发现，该通路能够介导血清疼痛介质释放，减轻颈椎病患者疼痛症状，并能抑制机体的炎症反应。此外该通路还能促进髓核细胞增殖[33]，减弱髓核细胞的凋亡[34]，调节髓核细胞的自噬[14]；NF-κB通路广泛存在于动物和人体细胞内，能够参与细胞对外界刺激的响应。何坚等[35]认为，NF-κB通路可通过释放多种炎症因子减轻颈椎间盘的炎症损伤。陈会滨等[36]在1项动物试验研究中发现，药物可能通过该通路对神经根型颈椎病发挥镇痛作用；FOXO是FOXO通路重要组成蛋白，研究证实该蛋白的缺失会促进椎间盘的退化[37]。值得一提的是，癌症信号通路尽管富集靶点较多，但其报道颈椎病相关甚少，其与颈椎病的相关机制有待进一步研究证实。此外，本研究中PI3K-Akt、MAPK、NF-κB、HIF-1、FOXO等通路富集靶点较多并参与髓核细胞凋亡、炎性反应等过程，可能成为今后研究黄芪桂枝五物汤治疗颈椎病的重要方向。

综上，本研究通过网络药理学方法，阐述了黄芪桂枝五物汤治疗颈椎病的活性成分、基因靶点、信号通路之间的相互关系，为今后黄芪桂枝五物汤治疗颈椎病分子层面的深入研究提供参考。