芸苔素对菜豆花色苷合成的影响

卫旭阳，刘婷婷，翟锡姣，邢国明，郑少文

（山西农业大学 园艺学院，山西太谷 030801）

菜豆（Phaseolus vulgarisLinn）是一种可以食用的豆科植物，俗称四季豆或豆角，属于豆科（Leguminosae sp.）菜豆属的菜豆种，属于1 年生草本矮生或蔓生植物，是以嫩豆荚和鲜豆粒作为菜用，营养价值高[1]，除含有矿物质以及维生素外，还富含蛋白质、脂肪和糖类，能够促进人体肠胃蠕动，增进食欲，促进血液循环[2]。花色苷属于黄酮类物质，是以黄酮为基础的一类物质，广泛存在于植物的根、茎、叶、花、果实中，在不同的酸碱度或金属离子的作用下呈现出不同的颜色，因而赋予了植物五彩缤纷的颜色[3]。花色苷具有预防多种疾病和生理保健的作用，在调节眼健康、代谢紊乱、心血管疾病、抗肿瘤、清除自由基等方面起到了一定的作用[4]。花色苷的合成主要受内因和外因的影响，内因主要包括酶活性、糖代谢的影响，花色苷合成的结构基因、转运和积累相关的基因、调节基因、MicroRNA 等，外因主要包括氮肥、钾肥、pH、温度、光照、植物激素等[5-6]。

芸苔素又称油菜素内脂，被称为第六大植物激素，能够显著提高植物叶绿素含量，增加叶面积，促进植物光合作用，提高植物抗逆性[7]。前人研究表明，外源喷施芸苔素能够显著增加葡萄果皮中花色苷的含量[8-9]。彭志红[10]在拟南芥的研究中发现，芸苔素通过对茉莉素的诱导来调控拟南芥中花青素的合成；袁利兵等[11]研究表明，在拟南芥中，芸苔素会通过诱导细胞分裂素的合成来影响花青素合成下游基因的表达，进而影响拟南芥中花青素的合成。在关于芸苔素对菜豆豆荚花色苷合成方面及其影响调控机制却鲜有报道。

本研究以紫架豆、紫龙架豆、东方红架豆、紫地豆为材料，研究花色苷积累与不同质量浓度芸苔素之间的关系，旨在为菜豆豆荚花色苷富集、品质提升提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试材料紫架豆（A1）、紫龙架豆（A2）、东方红架豆（A3）、紫地豆（A4）由石家庄先凤种业有限公司提供。芸苔素由山东贵合生物公司提供，有效成分含量为0.01%。

1.2 试验设计

试验材料提前20 d 进行培养箱育苗，至两叶一心时定植于山西农业大学园艺学院日光温室内，盆栽定植，栽培盆内径21 cm、高20 cm，每盆装混合基质3 kg。每个处理6 盆，每盆1 穴，每穴2 株，重复3次。每个处理之间行间距50 cm，列间距50 cm。定植后进行常规田间管理。定植14 d 后开始使用芸苔素进行处理，处理浓度为0（清水对照，B1）、0.05（B2）、0.10（B3）、0.15（B4）、0.20 mg/L（B5）。每14 d喷施1 次，共喷施3 次，分别对应菜豆苗期、伸蔓期、开花结荚期。

1.3 测定指标及方法

1.3.1 次生代谢物指标测定 采新鲜豆荚，至于冰盒内，带回实验室进行指标测定，类黄酮含量使用硝酸铝法测定[12]；豆荚花青素含量使用盐酸甲醇法测定[13]；原花青素含量使用盐酸-香草醛法测定[14]；花色苷含量使用pH 示差法测定[15]。

1.3.2 花色苷合成关键酶活性测定 取新鲜豆荚，并立即置于液氮中，带回实验室按照ELISA 试剂盒说明书（北京索莱宝科技有限公司提供），测定查尔酮异构酶（CHI）、二氢黄酮醇还原酶（DRF）、花青素合成酶（ANS）、类黄酮糖基转移酶（UFGT）活性。每个处理3 次重复，每个重复取样2 株。

1.4 数据分析

采用Microsoft Excel 2013 软件对数据进行处理和作图，利用SPSS 22.0 统计软件进行相关性分析和Duncan 法多重比较分析。

2 结果与分析

2.1 不同质量浓度芸苔素对菜豆总黄酮含量的影响

花色苷属于黄酮类物质，总黄酮含量能够较为直观的表现出花色苷合成通路中各成色物质的总积累量，进而反映出芸苔素对于菜豆豆荚花色苷合成的影响。从表1 可以看出，不同浓度的芸苔素对于菜豆豆荚中总黄酮的含量会产生不同程度的影响，经过浓度B3 的芸苔素处理之后，各品种均与对照间差异差异，菜豆A1、A2、A3、A4 品种的总黄酮含量分别比对照高出了67.21%、36.62%、43.01%、58.47%，品种A1、A4 在浓度B3 时总黄酮含量最高，品种A2、A3 则在浓度B4 时总黄酮含量最高，且均与其对照间差异差异，喷施芸苔素可以增加菜豆豆荚中总黄酮的含量，但随着浓度的升高总黄酮含量呈现出先升高后降低的趋势，喷施芸苔素对菜豆总黄酮合成起到了促进作用。

表1 不同质量浓度芸苔素对菜豆总黄酮含量的影响Tab.1 Effects of different mass concentrations of brassin on the content of total flavonoids in beans mg/g

2.2 不同质量浓度芸苔素对菜豆原花青素含量的影响

原花青素是花色苷合成通路上的中间物质，原花青素含量的高低可以反映出芸苔素影响的花色苷合成的过程。由表2 可知，不同质量浓度芸苔素处理后，菜豆豆荚中的原花青素含量产生了不同程度的变化，品种A1 表现为不同处理相较于对照组原花青素含量分别增加了25%、44%、8%、0，B2、B3 处理与对照间差异显著，B3 处理的原花青素含量最高；品种A2 在不同质量浓度芸苔素处理下原花青素含量较对照分别增加了34%、55%、16%、16%，且B2、B3 处理与对照组B1 间差异显著，B3处理的原花青素含量最高；品种A3 在不同质量浓度芸苔素处理下原花青素含量较对照组分别增加了40%、172%、116%、40%，B3、B4 处理与对照B1间差异显著，其中，B3 处理的原花青素含量最高；品种A4 在不同质量浓度芸苔素处理下原花青素含量分别提高了5%、55%、22%、77%，在B3、B4 处理下与对照组间差异显著，其中，B5 处理下原花青素含量最高；说明经过EBR 处理能够显著增加菜豆豆荚原花青素的含量，且浓度B3 对各个品种均产生了显著影响。

表2 不同质量浓度芸苔素对菜豆原花青素含量的影响Tab.2 Effects of different mass concentrations of brassin on procyanidins content in beans mg/g

2.3 不同质量浓度芸苔素对菜豆花青素含量的影响

花青素是花色苷合成的前体物质。由表3可知，在不同质量浓度芸苔素处理下，品种A1 豆荚中花青素含量较对照组分别提高了68.92%、139.54%、114.68%、59.32%，其中，B3处理的花青素含量最高，且只有B3 处理与对照间差异显著；品种A2 各处理较对照组分别提高了13.83%、50.59%、34.38%、20.15%，其中，B3 处理的花青素含量最高，且B2、B3、B4、B5 处理均与对照间差异显著；品种A3 表现为各处理较对照组花青素含量分别降低34.40%、8.40%、20.77%、15.58%，其中，对照组的花青素含量是最高的，B2 处理较对照组显著减少；品种A4在不同质量浓度芸苔素处理下较对照组花青素含量产生了不同程度的变化，不同处理下花青素含量分别增加了61.18%、100%、119.07%、103.94%，其中，花青素含量最高的是B4 处理，B2、B3、B4、B5处理均与对照组间差异显著。在B3 处理下能够显著增加各品种菜豆豆荚花青素的含量。

表3 不同质量浓度芸苔素对菜豆豆荚花青素含量的影响Tab.3 Effects of different mass concentrations of brassin on anthocyanin content in bean pods mg/g

2.4 不同质量浓度芸苔素对菜豆花色苷含量的影响

从表4 可以看出，不同质量浓度芸苔素对菜豆花色苷合成产生不同程度的影响，品种A1 表现为，各处理相较于对照花色苷含量分别提高了61.45%、44.19%、37.91%、30.66%，其中，B2 处理的花色苷含量最高，且其他处理均与对照组间差异显著；品种A2 表现为各处理相较于对照组花色苷含量分别提高了20.06%、34.61%、23.70%、29.64%，且各处理均与对照组间差异显著；品种A3 表现为B3 处理花色苷含量最高，相较于对照组含量提高了52.66%；品种A4 表现为，B4 处理花色苷含量最高，相较于对照组提高了114.51%，B3、B4 处理下，能够显著增加各品种菜豆豆荚中花色苷的含量。

表4 不同质量浓度芸苔素对菜豆豆荚花色苷含量的影响Tab.4 Effects of different mass concentrations of brassin on the content of cyanins in bean pods mg/g

2.5 不同质量浓度芸苔素对菜豆豆荚查尔酮异构酶（CHI）活性的影响

查尔酮异构酶能够催化查尔酮环的闭合，形成类黄酮物质。由图1 可知，在不同质量浓度芸苔素处理之后品种A1、A4 表 现 为B2 处理 下CHI 活 性最高，品种A2 表现为B4 处理下CHI 活性最高，品种A3 表现为B1 处理下CHI 活性最高，且与其他处理间差异显著，说明外源喷施芸苔素并不能显著影响到CHI 活性。

图1 不同质量浓度芸苔素对菜豆豆荚查尔酮异构酶（CHI）活性的影响Fig.1 Effects of different mass concentrations of brassin on chalcone isomerase（CHI） activity in bean pods

2.6 不同质量浓度芸苔素对菜豆豆荚二氢黄酮醇还原酶（DFR）活性的影响

二氢黄酮醇还原酶（DFR）的作用是将二氢黄酮醇还原为无色花色素，无色花色素是花青素合成的前提物质。由图2 可知，不同质量浓度芸苔素对豆荚中DFR 活性产生不同程度的影响，低质量浓度时并未与对照产生较大差异，随着浓度的升高DFR 活性也在逐渐升高，当达到B3 时，品种A3、A4 的DFR 活性达到最高，且与其他处理间差异显著，当B4 处理下品种A1 的DFR 活性达到最大，但在喷施芸苔素之后，品种A1、A2 的DFR 活性出现降低，由此可知，这2 个品种对于芸苔素并不敏感，浓度B3 对菜豆豆荚DFR 活性影响较大。

图2 不同质量浓度芸苔素对菜豆豆荚二氢黄酮醇还原酶（DFR）活性的影响Fig.2 Effects of different mass concentrations of brassica on dihydroflavonol reductase（DFR）activity in bean pods

2.7 不同质量浓度芸苔素对菜豆豆荚花色素合酶（ANS）活性的影响

花色素合酶（ANS）的作用是催化无色花色素合成花色素，花色素是花色苷合成的前体物质。由图3 可知，不同质量浓度芸苔素对ANS 活性产生不同程度的影响，A1 品种的处理B4 相较于对照酶活提高21.39%，但并未与对照产生显著性差异；A2品种的B3 处理相较于对照酶活提高了26.65%，且与对照间差异显著；A3 品种的B3 处理相较于对照提高了32.4%，且与对照间差异显著；A4 品种的B3处理相较于其对照酶活性升高了18.33%，但并未与对照产生显著性差异，由此可知，外源喷施B3 浓度的芸苔素能够提高菜豆豆荚中ANS 活性，并能够显著影响品种A2 和A3。

图3 不同质量浓度芸苔素对菜豆豆荚花色素合酶（ANS）活性的影响Fig.3 Effects of different mass concentrations of brassin on anthocyanin synthase（ANS） activity in bean pods

2.8 不同质量浓度芸苔素对菜豆豆荚类黄酮糖基转移酶（UFGT）活性的影响

不同质量浓度芸苔素对菜豆豆荚类黄酮糖基转移酶（UFGT）活性的影响如图4 所示。

图4 不同质量浓度芸苔素对菜豆豆荚类黄酮糖基转移酶（UFGT）活性的影响Fig.4 Effects of different mass concentrations of brassin on flavonoid glycosyltransferase（UFGT）activity in bean pods

类黄酮糖基转移酶（UFGT）能够催化不稳定的花色素与葡萄糖进行结合，形成稳定的花色苷，这是花色苷合成的最后一步。由图4 可知，A1 品种的处理B4、B5 较对照的UFGT 活性分别提高了16.48%、11.75%，且均与对照间差异显著；A2 品种的B2、B3、B5 处理与其对照间差异显著，酶活性较对照分别提高了43.09%、50.72%、39.28%；品种A3 的各处理相较于对照均产生显著性差异，酶活性较对照分别提高了40.30%、31.50%、20.55%、50.92%，其中，B5 处理的酶活性最高；A4 品种的B2 与B3 处理较对照酶活性分别提高了48.65%、38.56%，并与对照间差异显著。由此可见，外源喷施浓度B2、B3 芸苔素能够显著增加品种A2、A3、A4 豆 荚 中UFGT 活 性。

2.9 花色苷合成相关物质与相关酶活的相关性分析

由表5 可知，原花青素含量与花青素含量、花色苷含量呈极显著正相关，DFR 活性与原花青素含量和花色苷含量呈显著正相关，ANS 活性与原花青素含量、花青素含量呈显著正相关，且ANS 活性与UFGT 活性间呈显著相关。

表5 花色苷合成通路相关物质含量与相关酶活性的相关性Tab.5 Correlation between the content of related substances in anthocyanin synthesis pathway and related enzyme activities

3 结论与讨论

本研究表明，在正常生长条件下，外源喷施芸苔素能够显著增加菜豆豆荚中总黄酮、原花青素、花色素以及花色苷的含量，不同浓度芸苔素对菜豆中各成色物质影响程度各不相同，这与高翔等[16]在酿酒葡萄中研究结果相同。马文婷等[17]对蛇龙珠葡萄的研究表明，外源喷施芸苔素能够提高果实内源ABA 的含量，而ABA 直接参与到葡萄果实花色苷的合成，进而促进了花色苷的合成。谢琳淼等[18]研究表明，在蓝莓的着色期通过喷施0.4 mg/L 的芸苔素内酯可以显著提高其花色苷的含量。

本研究表明，不同浓度芸苔素对菜豆花色苷合成通路上各关键酶活性产生不同程度的影响。在花色苷合成通路上，查尔酮经查尔酮异构酶催化形成二氢黄酮醇，二氢黄酮醇在类黄酮3′5′-羟化酶（F3′5′H）或者类黄酮3′-羟化酶（F3′H）催化作用下合成二氢杨黄酮或者二氢槲皮素，在二氢黄酮醇4-还原酶（DFR）催化作用下合成原花青素，原花青素在花色素合酶（ANS）催化下合成花青素，花青素通过类黄酮糖基转移酶（UFGT）催化合成花色苷。原花青素、花青素含量能够直观表现出花色苷合成过程中各物质的变化量，以及芸苔素对花色苷合成通路的影响[19-21]。不同浓度芸苔素处理之后对菜豆豆荚中CHI 活性并未产生显著影响，但对DFR、ANS、UFGT 等关键酶活性产生了显著影响，显著提高了其酶活性。这与马立娜等[22-23]芸苔素内酯在葡萄果实花色苷合成研究中的结论相同，外源芸苔素能够显著增加葡萄果实中UFGT 活性。DFR、ANS 活性的提高都能够显著提高菜豆中原花青素含量。

本研究发现，芸苔素通过对CHI 等花色苷合成相关酶活性的影响，来影响豆荚中花色苷的合成，即喷施芸苔素能够显著提高DFR 活性，增加了原花青素的合成，来增加花色苷合成通路中上游底物的合成；通过提高ANS 活性，增加了花青素的含量；通过对UFGT 活性的增加，促进了花色苷的合成，增加菜豆豆荚中花色苷的含量。

本研究表明，外源喷施0.1 mg/L 芸苔素能够显著增加菜豆中总黄酮、原花青素、花青素及花色苷含量，能够显著提高豆荚中CHI、ANS、UFGT 活性，但对于芸苔素对菜豆豆荚花色苷合成的分子机制还需要进一步研究。