芦笋主要病毒病的研究进展

叶艳英，尹玉玲，张冰冰，汤泳萍，周劲松，罗绍春

（江西省农业科学院蔬菜花卉研究所，江西南昌 330200）

芦笋（Asparagus officinalisL.）又名石刁柏，为天门冬科天门冬属多年生宿根性草本植物，其嫩茎质嫩味美，风味独特，是一种深受消费者喜爱的营养保健型高档蔬菜，被誉为“蔬菜之王”[1]。芦笋富含甾体皂苷、黄酮类、维生素、膳食纤维及植物多糖等多种活性成分，具有很好的药用价值和保健功能[2-3]。2020 年芦笋已正式列入新型冠状病毒肺炎中医诊疗方案及预防方案药食同源目录[4]。我国芦笋产业发展迅速，2016 年栽培面积已达12 万hm2，芦笋的播种面积和出口量均超过世界总量的50%，年产值达数百亿元[5]。

目前，在多国发现芦笋受到衰退综合症的影响，这种综合症缩短了芦笋的生产年限，也降低了芦笋的产量和质量，病毒病是引起衰退综合症的一个重要原因，并可使芦笋植株更易受到生物和非生物胁迫[6]。至今在芦笋上发现了10 种病毒：拟南芥花叶病毒(ArMV)、草莓潜伏黄斑病毒(SLRSV)、番茄黑环病毒(TBRV)、烟草条纹病毒（TSV）、黄瓜花叶病毒（CMV）、烟草花叶病毒(TMV)、苜蓿花叶病毒(AMV)、天 门 冬1 号 病 毒(AV-1)、天 门 冬2 号 病毒(AV-2)和 天 门 冬3 号 病 毒（AV-3）[7-9]。其 中，AV-1、AV-2 和AV-3 这3 种 病 毒，芦 笋 是 天 然 的宿主。AV-1 和AV-2 在北美与欧洲的商业芦笋田很常见，这2 种病毒也是大陆芦笋的最主要病毒，而AV-3 只在日本发现[10]。TSV 和CMV 最早分别于丹麦和德国被发现，其他的几种病毒病发生较少。笔者对主要的芦笋病毒病的研究进展进行概述，旨在为芦笋病毒相关研究提供借鉴，为培育优质高产的芦笋提供理论和实践基础。

1 天门冬1 号病毒（AV-1）

1.1 AV-1 基因组结构

天门冬1 号病毒（AV-1）是马铃薯Y 病毒科马铃薯Y 病毒属的成员，AV-1 是一种弯曲的丝状病毒，长770～790 nm，宽13 nm[11]。AV-1 是单链正义RNA 病毒，基因组长度为9 741 nt，不包括3′端多聚poly（A）尾，编码一个包含3 112 个氨基酸的多聚蛋白，分子质量为342 ku[12]。

AV-1 基因组RNA 的5′末端连帽状病毒编码的VPg 蛋白，3′末端由poly（A）尾巴组成，编码区为单一开放阅读框（ORF）。ORF 可表达产生一个多聚蛋白前体，包含10 种蛋白：P1 蛋白（333aa）、HCPro 辅助蛋白酶（458aa）、P3 蛋白（351aa）、6K1 蛋白（52aa）、CI 柱 状 包 含 体 蛋 白（643aa）、6K2 蛋 白（53aa）、VPg 病毒基因组连接蛋白（193aa）、NIa 核内含体蛋白a（243aa）、NIb 核内含体蛋白b（518aa）和CP 外壳蛋白（268aa）。

笔者对NCBI 上登录的16 个AV-1 分离物的CP基因进行序列比对分析，16 个分离物的CP基因均为443 个碱基。16 个分离物的CP基因同源性高，核苷酸序列同源性在96.8%～100%，氨基酸同源性在95.2%～100%。

1.2 AV-1 对芦笋的危害

TOMASSOLI 等[6]对西西里岛和坎帕尼亚采集的650 多个芦笋样品进行检测，54%样品检测出AV-1，86%取样点发现有被病毒侵染，发病率最高的是老植株。

芦笋感染病毒病会影响其质量，导致弯曲笋、细笋、散头笋明显增多，同时会使植株变得瘦弱，严重影响芦笋品质。由于感染病毒的植株没有明显症状，因此，常常被忽视其造成的经济损害[13]。欧洲种植的芦笋感染AV-1，减产可达30%～70%[13-14]；对云南燕山县芦笋病害调查发现，由于AV-1 危害导致芦笋产量下降了25%[15]；受AV-1 危害，芦笋茎长降低了12%～20%、茎质量降低了10%～33%[16]。

1.3 侵染途径

在芦笋中发现了3 种机械传播的病毒：TSV、AV-1 和AV-2[17-18]。AV-1 同绝大多数的马铃薯Y病毒一样,是以非持续性传播。除了机械传播外，还主要通过桃蚜与豆蚜传播，不通过种子进行传播。

2 天门冬2 号病毒（AV-2）

2.1 AV-2 基因组结构

天门冬2 号病毒(AV-2)是雀麦花叶病毒科等轴不稳定环斑病毒属第2 亚组中的一员，是一种小型球形病毒[11]。AV-2 基因组结构为三分体正义单链mRNA，5′末端有帽状结构，3′末端无poly（A）尾巴。AV-2 全基因组由RNA1、RNA2、RNA3 和亚基 因 组RNA4 组成[19]。RNA1 的长度是3 431 nt，是一个单一的ORF，编码P1 蛋白，含有1 076 个氨基酸，分子质量为121 ku，同时包含一个甲基转移酶区 域 和 解 旋 酶 信 号，RNA1 的5′UTR 和3′UTR 分别为72、128 nt。RNA2 的长度为2 916 nt，其ORF的5′端编码P2 蛋白，含790 个氨基酸，分子质量91 ku，包含聚合酶信号，ORF 的3′端编码2b 蛋白，含193 个氨基酸的，分子质量21 ku。RNA2 的5′UTR 和3′UTR 分别为72、194 nt。RNA3 包含2 个ORF，ORF1 编码运动蛋白MP，含281 个氨基酸，MP 是参与病毒在细胞和细胞间运动的重要蛋白，ORF2 编码外壳蛋白CP，含217 个氨基酸。CP 是由RNA3后半部分对应的亚基因组RNA4翻译[19-20]。

笔者对AV-2 的7 个分离物的CP基因进行序列比对分析，7 个分离物的CP基因均为654 个碱基，编码217 个氨基酸。核苷酸序列同源性在99.1%～100%，核苷酸在240、314、439、446、465 和555 位置处存在差异。氨基酸同源性在99.1%～100%，氨基酸在105 和149 位置处存在差异。发现AV-2 分离株的外壳蛋白(CP)的遗传变异性非常低，且均高度保守，在分离株间具有大于99%的同源性，这与SHIMURA 等[21]的研究结果相一致。

对AV-2 的7 个分离物的2b基因进行序列比对分析，7 个分离物的2b基因均为582 个碱基，编码193 个氨基酸。核苷酸序列同源性在99.3%～100%，核苷酸在51、166、167 和194 位置处存在差异。氨基酸同源性在98.5%～99.5%，氨基酸在56和65 位置处存在差异。

2.2 AV-2 对芦笋的危害

2.2.1 病毒发病率高 据调查统计，密歇根芦笋种植田有50%～70%的植株感染AV-2，且大多数是种植了5 a 以上的植株[22]。当芦笋父本感染AV-2时，子代幼苗中有16.7%植株携带AV-2；只有母本感染时，子代幼苗中有46.6%植株携带AV-2；当父母本都感染时，有94.5% 子代植株携带AV-2[23]。

2.2.2 影响品质和产量 芦笋感染了AV-2，导致减产大约25%，在收获期1～5 a，商品笋平均产量分别降低14%、28%、20%、48%和57%，次品笋产量分别提高93%、105%、207%、352%和167%；未受AV-2 危害的植株商品笋产量逐年增加，直到第5 年到达高峰，而受AV-2 危害的植株产量增长到第3 年后便开始逐年下降[24]。

2.2.3 影响授粉和种子质量 芦笋感染病毒对幼苗适宜性、植株的生长、授粉能力和种子发芽率都有显著影响。芦笋亲本植株感染AV-2 可导致花朵发育受损，会使授粉成功率降低21%～29%，种子质量减少11%～8%，种子数量减少12%～46%，种子萌发率降低8～23%，芦笋幼苗活力下降4%～15%[23]。

张连长还想争辩,曲干事把他扯到一旁,低声说:“我不是装好人,明摆着,只能先收在你们连了!这老爷子要不高兴起来,团长也会不高兴,师长也会不高兴,这点事儿你都不懂?”

2.2.4 影响幼苗生长 芦笋幼苗感染AV-2 时，植株的生长速度和活力都会降低，AV-1 和AV-2 这2 种病毒同时存在时，芦笋植株在发病2 a 后会出现严重的衰退和死亡[17]。AV-l 或AV-2 单一感染时导致芦笋幼苗生长和存活率下降10%～20%，而AV-l 和AV-2 双重感染时则使芦笋幼苗生长和存活率下降40%～70%[24]。

2.2.5 影响组培快繁 此外，芦笋病毒病对芦笋快繁可产生影响，会降低外植体的生根率和存活率，无病毒的外植体生根率为40%～45%。感染病毒的植株上取的外植体在组培过程中根系发育缓慢，存活率降低15%～75%，培养28 d 后，感染AV-1的芦笋组培苗生根率为14%～30%，感染AV-2 的生根率为28%～32%，感染2 种病毒的外植体生根率仅为6%～20%[25]。

2.3 侵染途径

AV-2 主要是通过机械和种子传播[26-27]。芦笋是一种异花授粉的植物，通过风吹传播或蜜蜂携带花粉以及蓟马的摄食活动等方式传播，AV-2 通过花粉传播可使病毒传入健康的植株，使其在植株内迅速传播[20,22]。EVANS 等[22]从感染AV-2 的芦笋植株花粉中检测到AV-2 的病毒粒子，并在花粉外膜上定位到病毒抗原，证实AV-2 可通过授粉活动进行传播。另外，农事操作如用被AV-2 污染的切刀或者割草机等切割母茎也是机械传播AV-2 的途径之一，且易在较老的植株中广泛传播。

芦笋种子感染AV-2达5%～60%，平均为22%。由于种子感染AV-2 比例高，因此，受感染的种子是AV-2 最初进行传播的最可能来源，携带AV-2的种子进行交流可能会把AV-2 传播到全世界，特别是在偏远地区和新西兰等岛国，意大利[28]、北美[17]和新西兰[29]芦笋感染AV-2 的比例也很高。

3 芦笋其他病毒病

3.1 天门冬3 号病毒（AV-3）

AV-3 最早从日本的芦笋中分离出来,被归类为马铃薯X 病毒属的成员。AV-3 的全基因组长度为6 937 nt，不包括poly（A）尾，5′UTR 和3′UTR 分别为81、101 nt。基因组RNA 中包括5 个ORF，ORF1（82～4 926 nt）编码一个182 ku 的RNA 聚合酶（RdRp），ORF2（4 959～5 702 nt）、ORF3（5 635～5 994 nt）和ORF4（5 837～6 094 nt）分别编码28 ku TGBp1、13 ku TGBp2 和9 ku TGBp3 的 蛋 白 质，称为三基因阻断蛋白（TGBps），ORF5（6 144～6 836 nt）编码26 ku 的外壳蛋白（CP）[11]。到目前为止，除日本外，还没有其他国家报道该病毒，因此，关于其特性和对产量影响的相关信息较少。

3.2 黄瓜花叶病毒（CMV）

CMV 是黄瓜病毒科黄瓜病毒属中的一员。芦笋上CMV 最早在德国发现[30]。受CMV 感染的芦笋无典型症状，CMV 可以通过超过80 种蚜虫以非持久性的方式进行传播。CMV 的芦笋分离物很容易通过机械方式接种到藜麦和苋属等草本指示植物上，接种后引起叶片典型局部病变，以及系统花叶[10]。CMV 已知在至少20 种植物中通过种子传播，但没有关于CMV 病毒通过种子和花粉在芦笋中传播的报道。发现芦笋上经常混合感染CMV 与AV-1，同时感染2 种病毒对芦笋产量的影响更大，如感染AV-1+CMV 造成芦笋减产,最高可达70%；感染AV-2+CMV 可导致减产20%～49.5%[12]。

3.3 烟草条纹病毒（TSV）

TSV 是等轴不稳环斑病毒属中的一员，芦笋上的TSV 最早在丹麦的芦笋中被分离出来，然后根据生物学、物理和血清学特性，该分离物被证明与TSV 有关[10]。美国加州的芦笋在自然条件下也可感染TSV，但地中海国家的芦笋上未检测到TSV。感染TSV 的芦笋植株发育不良，茎部呈褪绿或褐色条纹，拟叶变褐色，TSV 在芦笋中不能通过种子传播，但可以通过蓟马携带传播[31]。

4 芦笋病毒病的检测方法

4.1 指示植物法

藜麦是很好的指示植物,用于检测AV-1 的存在与否，藜麦接种AV-1 病毒4～12 d 后，接种叶上出现褪绿、红棕色或黄色斑点，而后受影响的组织开始坏死[30]。另外，本氏烟也可用于鉴别AV-1 分离株[32]。

4.2 血清学检测法

JASPERS 等[17]使用酶联免疫吸附法（ELISA）成功检测了芦笋枝条AV-2的感染情况。HOWELL等[33]采用血清学法区别不同地域来源的AV-1 病毒株系。此外，芦笋CMV 病毒也可通过ELISA 进行检测[30]。

4.3 电镜观察法

电镜法是通过观察病毒颗粒形态、大小、结构、内涵体组成和亚结构等特征来确定芦笋病毒是否存在。FUJISAWA[8]通过提纯分离芦笋病毒粒子，用提纯液来做电镜制片，观察到了AV-3 的粒子形态结构。LI 等[15]利用电子显微技术观测到国内首例AV-1 病毒长度等。

4.4 分子生物学检测法

分子生物学检测法比血清学法的灵敏度要高,特异性强，有着更快的检测速度，操作也比较简便，可用于大量样品的检测。TOMASSOLI 等[6]利用AV-1 病毒外壳蛋白CP 区域设计特异引物，建立RT-PCR 反应体系，对不同地区采集的芦笋样品进行AV-1 检测。JASPERS 等[17]利用已发表的AV-2 外壳蛋白核苷酸序列（Genbank 登录号×86352）设计引物，用于检测AV-2。

5 芦笋病毒病的防治

5.1 选育抗病品种

选育抗病毒品种是防治病毒病的最有效措施，目前研究者们发现了对芦笋病毒病具有抗性的资源。TOMASSOLI 等[34]研究表明，芦笋野生近缘种A. maritimus感染病毒率低于10%。此外，TIBERINI 等[35]在意大利芦笋田中发现A. albus、A.amarus、A. stipularis和A. horridus无AV-1 感染。NOTHNAGEL 等[36-37]对44 个芦笋栽培种、基因文库和育种系以及34 个芦笋野生近缘种进行AV-1 抗性评价，发现A.amarus、A.verticillatus、A.prostratus、A.maritimus、A.acutifolius和A.stipularis未检测到AV-1，这些抗性种质资源由二倍体、四倍体和六倍体组成，分别来自欧亚和非洲，其中，地中海野生近缘种A. amarus对AV-1 具有完全抗性，且A.amarus为六倍体。这些抗性资源的发掘为芦笋抗病毒病育种提供了新的契机。

5.2 农业措施

芦笋种子携带病毒是重要的毒源，因此，在播种前对种子进行消毒处理能在一定程度上降低病毒病发生的可能性。合理密植、合理施肥、灌溉、培育壮苗、拔除早期病株、农具与机械进行消毒消除潜在病毒等措施可减轻病害发生[38-39]。

5.3 传播介体防控

传播介体主要是蚜虫、粉虱、蓟马等，可通过阻碍传播媒介传播，达到防治病毒目的[40]。物理防治：利用黄板或蓝板、性诱剂等趋避蚜虫、粉虱、蓟马，大棚的通风口安装防虫网进行隔离。生物防治：可通过释放捕食性或寄生性天敌的方式防治蓟马，从而减少芦笋病毒病的发生。化学防治：在芦笋生长过程中，使用高效、低毒、低残留农药防控蚜虫、粉虱、蓟马。

6 展望

芦笋质嫩味美、富含生物活性因子，具有很好的药用保健功效，且被列入新型冠状病毒肺炎中医诊疗方案预防方案目录。近年来，国内芦笋产业发展速度迅速，产业规模不断扩大。芦笋病毒病使芦笋产量降低，使芦笋散头造成商品性大打折扣，影响出口创汇。笔者认为今后应该从以下几个方面开展研究：（1）建立脱毒种苗繁育体系。目前，并无抗病毒病的芦笋品种，而芦笋主要传播途径之一是带病毒的种子进行传播，因此，获得优良的芦笋脱毒苗是当前防治芦笋病毒病的主要方法之一，所以，对芦笋进行茎尖脱毒种苗快速繁育研究尤为重要。（2）建立快速、简便、特异性强的芦笋病毒病检测方法。笔者发现很多芦笋园中有疑似病毒病的植株，因此，建立快捷检测方法为更好地研究芦笋病毒在田间的侵染率、发生情况等方面提供依据，也为脱毒种苗的生产提供了技术保障，是有效开展芦笋病毒病综合防治工作的关键，对芦笋的稳产、高产具有重要的现实意义。（3）加强抗病毒资源鉴定、筛选与利用。目前为止还没有育成抗病毒的品种，主要是因为品种的共同起源导致遗传背景狭窄。防治芦笋病毒病最经济且有效的方法就是发掘天然的抗病毒病的种质资源和抗病毒基因，利用野生近缘植物作为抗性来源是现代植物育种的常用策略。将发掘的高抗病毒病的芦笋野生近缘种通过种间杂交、胚胎拯救和离体再生技术有可能将野生种中的抗性转移到栽培种中[41-42]。这为今后培育抗病毒病的芦笋品种提供了可能，因此，应加强对抗性资源的鉴定、筛选和开发利用。另外，应加快芦笋病毒病致病的分子机理和植物抗病毒病的分子机理等方面的基础研究。