半夏外植体消毒方法比较研究

张兆萍，陈 芳，王玉红，张梅秀，龚永福，王 笑，臧广鹏，常 瑜，魏玉杰*，苏毓杰

(1.甘肃省农业工程技术研究院，甘肃武威 733006；2.甘肃省特种药源植物种质创新与安全利用重点实验室，甘肃武威 733006)

半夏[(Thunb.)Breitenb]又名三兴草、地星、三叶半夏等，为天南星科半夏属多年生草本植物，干燥块茎具有燥湿化痰、降逆止呕、消痞散结的功效。除内蒙古、新疆、青海、西藏外，全国其他各地广布野生半夏，其已有2 000多年的临床药用历史，是30种应用最广泛的中药之一。传统中药以采挖野生半夏为主，但由于半夏资源超量开发与利用，野生半夏资源已日渐枯竭。为满足药用需求，半夏人工栽培的面积不断扩大，但在生产过程中发现，栽培半夏多采用小块茎、珠芽等方法进行繁殖，不仅存在种苗短缺、繁殖系数较低的问题，而且多代无性繁殖易造成种质退化、病毒感染严重，引起叶片斑驳、变形、皱缩、卷曲等症状，使植株生长不良，减产可达60%，严重影响产量和药用品质，同时，由于各地间相互引种，造成种质资源混乱，药材质量难以保证。采用组织培养技术不仅可以有效地保存半夏种质资源，而且能进行优良品种的快速繁殖，满足生产上的需要，从而有效保障半夏品质。

半夏组织培养开始于20世纪80年代，经过众多科学工作者的不断探索研究，目前已逐渐形成一套完整的组织培养体系，但主要集中于脱毒快繁、遗传转化体系建立和生物碱代谢方面，而对外植体的选择相关研究较少。外植体本身所特有的因子对培养物的器官分化和形态建成有决定性的影响，因此，开展半夏组培过程中外植体种类及有效消毒方式的筛选对半夏胚性愈伤组织诱导十分必要。该研究分别以野生半夏和栽培半夏的珠芽和块茎2个典型取材部位为外植体，研究不同种类消毒剂组合对珠芽和块茎污染率、成活率的影响，分析比较野生与栽培半夏组织培养的差异，筛选出半夏适宜组织培养的外植体类型及最佳消毒方式诱导愈伤培养，以期为半夏组织培养快繁体系的建立及分子育种提供技术参考。

1 材料与方法

供试材料野生半夏块茎、株芽来自陇南市西和县，栽培半夏块茎、株芽来自天水市清水县。MS培养基购自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司，其余化学试剂均为国产分析纯。

外植体前处理。选择整齐、大小一致的野生半夏、栽培半夏块茎、珠芽，流水冲洗干净表层灰尘、泥土等物质，用手轻轻剥去种球、珠芽表层多余杂质；放入干净广口瓶内，用自来水冲洗数遍；加入少许洗洁精，轻摇冲洗30 min；反复用清水冲洗干净洗洁精，直至无泡沫；用超纯水冲洗5～6遍，放入紫外杀菌后的超净台，以备下一步工作。

外植体消毒处理及接种。外植体消毒处理见表1。每次消毒剂处理期间均需不停摇晃消毒瓶，保证外植体充分接触消毒剂，取出后用无菌水清洗5～6遍备用。分别将种球、珠芽放置于干净滤纸上，每个消毒处理接种60瓶，每瓶接种1个外植体，培养基为不添加激素的MS培养基。培养30 d后统计污染率和成活率。外植体接种后，光照强度2 000 lx，光照时间 12 h/d，培养温度(25±1)℃。

表1 不同消毒方式及处理时间Table 1 Different disinfection methods and treatment time

采用以下公式计算污染率和成活率。

污染率=(污染材料数/总接种材料数)×100%

(1)

成活率=(成活材料数/总接种材料数)×100%

(2)

试验数据用Excel整理，用SPSS 17.0软件进行方差分析及显著性分析。用隶属函数评价方法评价12个处理污染率和成活率。隶属函数值计算公式如下：

式中，表示第个指标值，为第个指标的最小值，为第个指标的最大值，若该指标与产量呈相反关系则为负向指标。

2 结果与分析

块茎消毒比较。从图1可以看出，NaClO和HgCl不同消毒浓度和处理时间对野生、栽培半夏块茎污染率和成活率影响很大。X～X处理为NaClO消毒，同一浓度随处理时间延长，野生和栽培半夏块茎均表现为污染率降低，成活率升高，但变化幅度较小，无显著差异；相同处理时间(X、X、X，X、X、X，X、X、X)，随着NaClO浓度升高，半夏块茎污染率降低，说明NaClO消毒浓度比其作用时间对半夏外植体污染率的影响更大。X～X处理为HgCl消毒，随着0.1% HgCl处理时间延长，野生、栽培半夏块茎污染率均表现为XX>X，栽培半夏块茎成活率为X>X>X。

X～X处理半夏块茎污染率在73.33%～95.56%，成活率在1.67%～22.22%，X～X处理半夏块茎污染率在10.56%～22.22%，成活率在64.44%～73.89%，可见采用HgCl进行半夏块茎消毒污染率显著低于NaClO，成活率显著高于NaClO。综合考虑污染率及成活率，可知适合半夏块茎消毒的最佳处理为X。比较野生半夏块茎和栽培半夏块茎污染率和成活率可知，相同消毒处理下，野生半夏块茎与栽培半夏块茎污染率多数表现为野生半夏块茎污染率低于栽培半夏块茎污染率，野生半夏块茎成活率高于栽培半夏块茎成活率。

注：不同小写字母表示同一品种不同处理间差异显著(P<0.05)Note：Different lowercase letters indicate significant differences among different treatments of the same variety(P<0.05)图1 不同消毒处理下野生与栽培半夏块茎污染率、成活率的比较Fig.1 Comparison of contamination rate and survival rate of wild and cultivated Pinellia ternata tubers under different disinfection treatments

珠芽消毒比较。从图2可以看出，采用HgCl对半夏株芽进行消毒处理(X～X)时，污染率显著低于NaClO处理(X～X)，成活率显著升高。不同NaClO处理时间及浓度对半夏株芽污染率影响较小，而株芽污染率为71.67%～91.11%，成活率均较低，为5.00%～23.33%，而采用HgCl处理时，株芽污染率降至7.22%～13.33%，成活率达66.11%～73.89%，故采用HgCl进行半夏株芽消毒效果较好。比较不同0.1% HgCl处理时间，野生、栽培半夏株芽污染率为XX>X，栽培半夏株芽成活率为X=X>X，综合考虑污染率及成活率，可以得出适合半夏株芽消毒的最佳处理为X。

由图2可知，野生半夏株芽与栽培半夏株芽污染率存在差异，多数表现为野生半夏株芽污染率低于栽培半夏株芽污染率，野生半夏株芽成活率高于栽培半夏株芽成活率。

注：不同小写字母表示同一品种不同处理间差异显著(P<0.05)Note：Different lowercase letters indicate significant differences among different treatments of the same variety(P<0.05)图2 不同消毒处理下野生与栽培半夏株芽污染率、成活率的比较Fig.2 Comparison of contamination rate and survival rate of wild and cultivated Pinellia ternata buds under different disinfection treatments

相同消毒处理下野生半夏不同外植体间消毒比较。由表2可知，同一处理野生半夏块茎与株芽间污染率、成活率存在差异，除X处理外，其余处理均为株芽污染率低于块茎污染率；除X、X、X外，其余处理株芽成活率均高于块茎成活率，污染率变化趋势与成活率呈相反趋势。

表2 相同消毒处理下野生半夏块茎与株芽间污染率、成活率的比较Table 2 Comparison of contamination rate and survival rate of tuber and plant bud of wild Pinellia ternata under the same disinfection treatment %

相同消毒处理下栽培半夏不同外植体间消毒比较。由表3可知，同一处理栽培半夏块茎与株芽间污染率、成活率存在差异，与野生半夏块茎、株芽变化规律一致，除X处理外，其余处理均为株芽污染率低于块茎污染率；除X、X外，其余处理株芽成活率均高于块茎成活率，污染率变化趋势与成活率呈相反趋势。

隶属函数法可以将定性评价转化为定量评价，还能消除单一指标的片面性，应用非常广泛。利用隶属函数法对12个处理污染率和成活率进行多指标综合评价，值越大，处理的外植体生长越好(表4)。X处理，野生块茎、栽培块茎、野生珠芽、栽培珠芽隶属函数平均值排名分别为3、9、1、4，均优于其他处理，表明X处理是适合半夏外植体消毒的最佳处理。

表3 相同消毒处理下栽培半夏块茎与株芽间污染率、成活率的比较Table 3 Comparison of contamination rate and survival rate of tuber and bud of cultivated Pinellia ternata under the same disinfection treatment %

3 讨论与结论

根据植物细胞的全能性，在植物组织培养过程中任何组织均可作为外植体，但不同部位组织脱分化和再分化难易程度不同，以及灭菌难度差异较大，所以在组织培养时外植体的选择十分重要。在半夏组织培养过程中，通常选用叶片、叶柄、块茎、茎尖、根和珠芽作为外植体。

该研究结果表明，相同的消毒处理下，野生半夏块茎、株芽污染率低于栽培半夏块茎、株芽污染率，且同种类型半夏品种株芽的污染率较块茎的污染率低。这可能是因为野生半夏生长环境单一，受外在条件影响小，而栽培半夏受人为施肥、打药等管理影响，生长环境相对复杂。同理，块茎染菌率高，较难消毒也可能是因为块茎生长于地下，环境复杂，相对株芽接触细菌及霉菌较多，不易清除，这与吴能表等的研究结果一致。

表4 隶属函数值及综合排名Table 4 Membership function value and comprehensive ranking

该研究结果还表明，分别以NaClO和HgCl作为消毒剂，野生、栽培半夏块茎、株芽的污染率、成活率均具有明显差异。且NaClO消毒浓度比NaClO作用时间对半夏外植体污染率的影响大。随着0.1% HgCl处理时间延长，外植体的染菌率逐渐减少，但成活率也有一定降低。HgCl和NaClO是植物组织培养中常用的消毒剂，其中HgCl消毒效果极佳，但HgCl为剧毒物质，对植物细胞伤害大。鉴于半夏的生长习性，组织培养时外植体细菌比较顽固，采用HgCl进行消毒效果佳，但如果消毒剂浸泡时间过长，则容易导致植物细胞受损严重而影响外植体的存活率，可见消毒时间越长对外植体伤害越大，这与金青等的研究结果一致。该试验最终筛选出采用X处理(75%乙醇50 s、0.1%HgCl10 min)时，半夏块茎、株芽消毒效果最好，此时污染率低，而成活率较好。